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申请/专利权人：贵州医科大学

摘要：本发明提供了一种基于邻位效应诱导的级联扩增检测方法，包括AuNPs、Pt@AuNPs、DNA‑Pt@AuNPs、cDNA1和cDNA2的制备，捕获界面的构建，靶标外泌体的提取和检测。该方法用于外泌体的检测，用于临床乳腺癌病人血液样本分析。本发明基于邻位效应诱导的强大扩增级联，使用纳米酶作为信号标记，进行比色分析方法，可用于准确和高灵敏度地检测肿瘤来源的外泌体。

主权项：1.一种基于邻位效应诱导的级联扩增检测方法，其特征在于，该方法为：S1、AuNPs的制备：将40mL2.2mM柠檬酸钠溶液加入到干净的锥形烧瓶中，并在100℃的水浴环境中搅拌5min，然后加入267μL的25mMHAuCl4进行反应10min，将反应温度调节至90℃；然后以2s的间隔依次加入267μL60mM柠檬酸钠溶液和267μL25mMHAuCl4溶液，继续重复上述以2s的间隔依次加入267μL60mM柠檬酸钠溶液和267μL25mMHAuCl4溶液的操作30min，得到含金纳米颗粒的溶液，即AuNPs溶液，冷却后，避光储存在4℃；S2、铂包金纳米粒子Pt@AuNPs的制备：将S1中得到的16mLAuNPs溶液在90℃水浴中加热5min，然后以20μLmin的速率加入694μL1.0mMNa2PtCl6溶液，再以20μLmin的速率加入8mL4.0mML-抗坏血酸，反应30min后，得到含铂包金纳米粒子的溶液，即Pt@AuNPs溶液，冷却至25℃，避光保存；S3、DNA-Pt@AuNPs的制备：将10μL100μMBindingStrand和200μL的S2中得到的Pt@AuNPs溶液混合，并在-20℃下冷冻3h，在室温下解冻后，将混合物以11500rpm离心10min后，将沉淀物用PBS缓冲液洗涤3次，将产物重新分散在PBS中，得到DNA-Pt@AuNPs，4℃条件下避光保存；所述BindingStrand的序列为：SH-AAAAAAGCCTGTACCTAGTTTAT；S4、cDNA1和cDNA2的制备：S401、cDNA1：将L1和PS1放入Tris-HCl缓冲液中，得到L1和PS1的混合液，95℃退火10min，自然冷却至室温，然后L1PS1双链的缺口通过孵育30UT4DNA连接酶过夜来密封，然后70℃灭活10min，加入100U核酸外切酶I和100U核酸外切酶III，37℃孵育60min，80℃灭活15min，得到cDNA1；所述L1和PS1的混合液中L1的浓度为12μM，PS1的浓度为10μM；所述L1的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述PS1的序列为：P'-GTGCCTGTACCTAGTTATACCCATCGCCCTACTTATTACGCTCATGTATTAAAAAATGC；S402、cDNA2：将L2和PS2放入Tris-HCl缓冲液中，得到L2和PS2的混合液，95℃退火10min，自然冷却至室温，然后L2PS2双链的缺口通过孵育30UT4DNA连接酶过夜来密封，然后70℃灭活10min，加入100U核酸外切酶I和100U核酸外切酶III，37℃孵育60min，80℃灭活15min，得到cDNA2；所述L2和PS2的混合液重L2的浓度为12μM，PS2的浓度为10μM；所述L2的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述PS2的序列为：P'-CCCAATATCATCAAAAAAAAATACATGAGCGTAATAAAAACAACCCCAGATAAG；S5、捕获界面的构建：在37℃的条件下，将BS和链霉亲和素包被的96孔板一起孵育2h，加入聚合酶缓冲液a继续孵育40min触发RCA反应，最后用Tri-HCl冲洗平板2次，得到捕获界面；所述聚合酶缓冲液a中含有1mMdNTP、10Uphi29聚合酶、1×DNA聚合酶缓冲、1μMS402中得到的cDNA2；所述BS的序列为：Biotin-TTTTTTTTTTTGATGATATTGGGCTTATCTGGGGTTGT；S6、外泌体的提取：在37℃下保持在含有5％CO2环境中，分别将MCF-10A，Hela，HepG2以及MCF-7在DMEM培养基中细胞培养48h后，然后5000g离心10min，10000g离心30min，收集细胞上清液，通过0.22μm孔径的膜过滤获得的上清液120000g离心70min，得到的沉淀物质，即为外泌体，用无菌PBS缓冲液洗涤后，-80℃下储存；S7、外泌体的检测：将S6中得到的外泌体稀释至不同丰度并与AP1TS、AP2、HP1、HP2、HP3混合，放入含MgCl2的Tris-HCl缓冲溶液中反应120min，然后加入S3中得到的DNA-Pt@AuNPs、聚合缓冲液b，得到反应液，室温保持120min；然后将所述反应液与S5中得到的捕获界面孵育30min，用PBS冲洗后，将板进一步与50μLTMBH2O2显色底物孵育以进行过氧化反应30min，最后引入50μL的2MH2SO4溶液终止过氧化反应，通过紫外-可见光谱测量吸光度，通过比色信号对所述外泌体进行定量分析；所述AP1TS为AP1探针和TS探针按1:1的杂交产物；所述聚合缓冲液b中含有1mM的dNTP、10Uphi29聚合酶、1×DNA聚合酶缓冲、3μM的S401中得到的cDNA1；所述反应液中以下各物质的浓度：AP1TS、AP2、HP1、HP2、HP3的浓度均为1μM，MgCl2的浓度为20mM；所述AP1TS中AP1的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；所述AP1TS中TS的核苷酸如SEQIDNO:4所示；所述AP2的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；所述HP1的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；所述HP2的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示；所述HP3的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示。

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