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申请/专利权人：上海海洋大学

摘要：本发明涉及生物检测技术领域，公开了一种用于快速捕获或检测细胞的微流控芯片，其结构包括至少一组微流控单元，微流控单元的结构包括相互连接的通道A和通道B，通道A内设有多组鱼骨形结构单元，通道B内设有微腔结构。通道A内修饰有DNA四面体，通过亲和素将能够识别捕获目标细胞的特异性适配体序列连接到DNA四面体上。本发明将鱼骨形结构和圆柱体微腔结构结合，提高了目标细胞例如食源性致病菌或肿瘤循环细胞的高效、低成本、特异性的捕获、富集和体外增殖效率，将捕获的细胞富集到很小体积的微腔结构中，进一步提高了体外培养的存活率。

主权项：1.一种用于快速捕获或检测细胞的微流控芯片，其特征在于，其结构包括至少一组微流控单元，微流控单元的数量为4～8组，呈环形阵列排布；每组微流控单元的结构包括相互连接的通道A和通道B，通道A和通道B为蛇形通道；包括直线通道和弧形通道；通道A和通道B的直线通道相互平行排布，相邻的直线通道的通过弧形通道相连；通道A的一端开设有进样口I，进样口I位于微流控芯片的外侧；通道A与通道B的连接处设有进样口II，通道B的末端为出样口，出样口位于微流控芯片的内侧位置；通道A和通道B的深度为80～200μm，宽度0.8～1.5mm；通道A内设有多组鱼骨形结构单元；所述的鱼骨形结构单元位于通道A的直线通道内的顶部；每组鱼骨形结构单元包括多个相互平行的鱼骨；每组鱼骨形结构单元包括6～12个鱼骨，以通道A的顶部为基准，鱼骨的深度为30～50μm，宽度为30～50μm；同组鱼骨形结构单元中，相邻鱼骨的间距为80～120μm；鱼骨的结构包括鱼骨微槽A和鱼骨微槽B，鱼骨微槽A和鱼骨微槽B与通道A直线通道的夹角分别为30～60度，鱼骨微槽A与鱼骨微槽B之间的夹角为80～100度；鱼骨微槽A与鱼骨微槽B的长度不相等；所有鱼骨的方向与流体的流动方向相同或相反；同一直线通道上、流体前进方向上，鱼骨形结构单元鱼骨微槽A和鱼骨微槽B的长度以1:1.8～2.1和1.8～2.1:1的比例间隔分布；同一直线通道上，相邻的鱼骨形结构单元的之间的最短距离为80～120μm；通道B内设有微腔结构，所述的微腔结构位于通道B的直线通道内壁的两侧；所述的微腔结构为圆柱体微腔结构，以80～120μm的相邻间距呈阵列依次分布，每个直线通道上的圆柱体微腔结构的数量随通道B直线通道的长度而变化；每个圆柱体微腔结构通过底部的矩形小通道连接到通道B直线通道；通道B的圆柱体微腔结构的直径为80～200μm，深度为80～200μm；所述的通道A内修饰巯基，并连接DNA四面体，且DNA四面体的一个顶点上用生物素修饰；DNA四面体的其余至少一个顶点上用酰胺类修饰，并通过迈克尔加成反应使DNA四面体固定在通道A的内表面；将识别捕获目标细胞的特异性适配体序列通过亲和素固定在修饰有生物素的DNA四面体顶点上，将特异性适配体的序列连接到通道A内表面；所述的DNA四面体用生物素修饰的顶点、或者特异性适配体的序列上带有DNA限制内切酶位点。

全文数据：一种用于快速捕获或检测细胞的微流控芯片及方法技术领域本发明涉及生物检测技术领域，具体为快速捕获或检测细胞的微流控芯片以及方法。背景技术食源性疾病通常是指摄取了随食物或饮水进入人体的生物性、化学性、物理性有害物而引起的疾病。近年来，由于微生物引起的食源性疾病在食品安全事件中的比例不断提升，给人类身体健康和生命安全构成了严重的威胁，肠致病性大肠杆菌是引起人体腹泻症状的常见病原菌，目前根据不同的生物学特征将致病性大肠杆菌分为6类，即肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠集聚性大肠杆菌以及近来发现的肠产志贺样毒素且具有侵袭力的大肠杆菌。其中，肠致病性大肠杆菌是引起全球婴儿急、慢性腹泻和成年人散发腹泻的一类重要致病菌。金黄色葡萄球菌，沙门氏菌等造成的污染也严重威胁到人类的健康，急性中毒轻者导致急性胃肠炎，呕吐、恶心、腹痛、腹泻、发烧等；重者会引起呼吸、循环、神经等系统症状，抢救不及时会危及生命；慢性中毒会导致致癌、致畸、致突变等。传统的细菌检测方法，如微生物培养和分离，这种检测方法灵敏度低，处理时间长，且需要经过培训的专门人员，同时并非所有的细菌都可以在实验室中培养，具有很大的局限性。在科学技术不断发展下，产生了新的检测方法，如分析免疫学方法、分子生物学检测技术、磁性荧光纳米检测法等，弥补了传统检测方法的不足。1分析免疫学方法，该检测方法是以抗原抗体的特异性反应为基础，在检测过程中，根据食物中微生物的特异性抗原特征，可激发机体产生与之相关的特异性抗体。免疫磁珠分离法、胶体金标记法、酶联免疫吸附法ELISA都属于免疫学常见的检测方法。免疫磁珠分离法适用于细菌富集，须与其他检测方法联用进行细菌的检测；胶体金标记法具有灵敏度高、特异性强、操作简单等特征，但是将其应用于食源性致病菌微生物的检测中时，可能由于抗原被样品中某些物质所掩蔽，从而产生假阴性反应，难以保证检测结果的准确性和真实性；ELISA检测方法灵敏度高，特异性强。检测速度快，但操作复杂。2分子生物学检测技术，从分子生物学水平上进一步研究微生物的分子，尤其是核酸结构及其相关组成部分，包括基因芯片检测、PCR检测方法等。基因芯片检测方法在检测食源性致病微生物过程中，以反应体积小、试剂消耗量小、检测速度快、灵敏度高等特点，提高了检测质量和效率，但是这种检测方法检测费用高、检测精度低；PCR检测方法实现了从定性到定量的飞跃，整个检测过程中不需要后续处理便能得到灵敏度高。精确度高的检测结果，但将其应用到食源性致病菌微生物检测中，食品中的成分会抑制PCR中酶的活性，在一定程度上降低了检测的准确度。3磁性荧光纳米检测法，将磁性纳米颗粒和荧光纳米颗粒通过预先设定好的方式相互结合，使其兼顾标记和富集的双重功能，在相互作用下产生较强的荧光，以提供较好的磁响应性、耐光性和光信号等，但从目前在食源性致病微生物的检测情况看，其应用范围有限，且其准确度，灵敏度及安全性不能确定。恶性肿瘤目前已成为世界上死亡率最高的重大疾病之一，而随着肿瘤发病率的日趋升高，人们对恶性肿瘤的认识和研究不断加深，90％以上肿瘤患者的死亡都是肿瘤转移所致。肿瘤细胞自发或因诊疗操作从原发肿瘤部位脱落并进入血液形成循环肿瘤细胞circulatingtumorcells,CTCs，CTCs是在血液循环系统中存活的肿瘤细胞，能够表征肿瘤病灶的分子特征，并被认为是肿瘤血行转移的主要途径。血液循环系统中检测到循环肿瘤细胞意味着癌症和可能的癌转移。因此，早期、高效和特异性的CTCs捕获不仅是肿瘤的早期诊断的一个有力手段，同时通过释放所获CTCs并针对其生物学活性、分子与功能进行深入研究和分析，也有利于肿瘤转移发生之前的风险评估和个性化治理方案的制定。而目前循环肿瘤细胞的捕获和活性分析等研究却面临着一些问题：1.癌症患者外周血中的CTCs十分稀少，每毫升血液中有多达1千万个白细胞和50亿个红细胞，但仅有几个至几百个CTCs，且研究表明这些CTCs具有较大的异质性，尤其是功能异质性；2.对血液样本中的预处理以及富集过程中对CTCs造成不可逆的损伤，导致细胞凋亡而影响后期的生物学活性研究，从而影响针对患者的实时治疗策略评价。因此，如何从癌症患者外周血中高效分离CTCs成为肿瘤“液态活检”所面临的重大挑战之一。目前已发展出许多富集技术可以用来捕获、分离CTCs,每一个富集平台都基于某种特性来分离和富集CTCs。其主要分为以肿瘤细胞物理特性和肿瘤细胞生物特性为基础的两大类方法，而后者中最为常见的分离方法是免疫磁性分离技术。磁性粒子在磁场作用下具有高特异性、可富集分离性，广泛用于CTCs的检测。分离原理是磁珠与特异性抗体结合后，再与含有特异性抗原的细胞识别即可形成细胞抗原-抗体-磁珠免疫复合物。复合物在磁力的作用下发生移动，既能实现CTCs与其他物质的分离。基于此原理的美国强生公司的CellSearch系统试剂盒，是目前唯一获得美国食品药品监督管理局FDA批准的应用于CTCs检测的系统。其优点是敏感度、特异性都较高，但缺点是该试剂盒价格较为昂贵，无法在临床上大量推广使用，且捕获效率也有限；除此之外，基于磁性颗粒的CTCs分离捕获在以下几个方面也表现出一些不足：1.依赖于高特异性的肿瘤相关抗原，捕获过程中会丢失部分CTCs；2.肿瘤细胞在磁场中易于发生聚集，对细胞造成机械性损伤，细胞形态和活性也会因此受到影响；3.与磁珠结合的细胞分离困难，可能影响后续检测。因此，需要发展新的高灵敏度，快速和低成本的分析技术，以避免多个操作步骤和长时间处理，从这个意义上说，微流控技术是一种在微米尺度流道内对液体进行操纵或控制的技术，具有低试剂样本消耗、快速、低成本、高通量、使用简便等优点。微流控技术是比较有前景的细菌细胞的捕获或检测工具。随着DNA纳米技术的日益成熟，适配体因其尺寸小，稳定，低生产成本，并且在化学合成过程中容易在其末端修饰特定基团，修饰的末端基团有助于将这些分子有效的固定在不同的传感器上面，因此，近几年，基于DNA适配体的微流控芯片传感器用于病原菌的检测成为研究热点。将微流控芯片用于循环肿瘤细胞的捕获，捕获方法可分为物理法和生物化学法两大类。目前常用而经典的应用中，属于物理法的有微结构过滤、惯性分选、确定性侧向位移等，属于生物化学法的有借助磁场力的免疫磁珠捕获法和无需外力场的被动式捕获法等。鱼骨形的微流控芯片可以打破低雷诺数时的层流状态，使流线呈现螺旋状态从而达到液体混合的目的，现用于DNA分子杂交、抗原抗体结合剂微粒分选等；也有将其用于捕获CTCs的研究。尽管如此，当前诸多基于微流控技术的CTCs分选技术中仍存在一些技术上的阻碍：1.固载了捕获抗体的微流控芯片虽有较好的CTCs捕获能力，但在释放CTCs以进行后续分析方面存在较大的困难；2.在进行细胞分选时，由于通道内剪切力或与管壁的碰撞等可能对细胞的生物活性造成一定损伤；3.此技术目前多用于CTCs分选、富集，而利用微流控芯片技术对CTCs进行体外培养的研究尚不完备且在芯片上集捕获、释放、培养的整合式研究也较少。因此，需要克服现有技术的不足，通过微流控芯片通道的设计，利用适配体与目标细胞上受体的结合，实现全血样品中CTCs或者食品样品中微生物尤其是食源性致病菌的特异捕获、检测、释放和富集培养，降低细菌或循环肿瘤细胞在捕获过程中的损伤，实现目标细胞的快速富集、检测和体外培养。发明内容本发明旨在提供一种用于快速捕获或检测细胞的微流控芯片及方法。一种用于快速捕获或检测细胞的微流控芯片，其结构包括至少一组微流控单元，微流控单元的数量为4-8组，呈环形阵列排布。优选的，微流控单元的数量为6个，呈环形阵列排布。每组微流控单元的结构包括相互连接的通道A和通道B，通道A和通道B为蛇形通道；通道A的一端开设有进样口I，进样口I位于微流控芯片的外侧；通道A与通道B的连接处设有进样口II，通道B的末端为出样口，出样口位于微流控芯片的内侧位置。通道A和通道B均为蛇形，包括直线通道和弧形通道。通道A和通道B的直线通道相互平行排布，相邻的直线通道的通过弧形通道相连；各组微流控单元中，每条直线通道长度不等，并且自微流控芯片的中心向外，直线通道长度逐渐增加。通道B的直线通道长度均小于通道A的直线通道长度。进样口II位于连接通道A和通道B的弧形通道上。通道A和通道B的深度为80～200μm，宽度0.8～1.5mm。通道A内设有多组鱼骨形结构单元；所述的鱼骨形结构单元位于通道A的直线通道的顶部。每组鱼骨形结构单元包括多个相互平行的鱼骨，相邻的鱼骨之间形成鱼骨间隙，鱼骨的高度即为鱼骨间隙的深度。每组鱼骨形结构单元包括6～12个鱼骨，优选为8～12个。鱼骨的宽度为30～50μm；以通道A的顶部为基准，鱼骨向上凹陷，深度30～50μm；同组鱼骨形结构单元中，相邻鱼骨的间距即鱼骨间隙的宽度为80～120μm。鱼骨的结构包括鱼骨微槽A和鱼骨微槽B，鱼骨微槽A和鱼骨微槽B与通道A直线通道的夹角分别为30～60度，鱼骨微槽A与鱼骨微槽B之间的夹角为80～100度；鱼骨微槽A与鱼骨微槽B的长度不相等。以流体流动的方向为正向，所有鱼骨的方向即鱼骨微槽A和鱼骨微槽B所形成的夹角的方向与流体的流动方向相同或相反。同一直线通道上、流体前进方向上，鱼骨形结构单元鱼骨微槽A和鱼骨微槽B的长度以1:1.8～2.1和1.8～2.1:1的比例间隔分布。同一直线通道上，相邻的鱼骨形结构单元的之间的最短距离为80～120μm。即，相邻鱼骨形结构单元的鱼骨微槽A或鱼骨微槽B之间的最短间距为80～120μm。通道B内设有微腔结构，所述的微腔结构位于通道B的直线通道内壁的两侧。所述的微腔结构为圆柱体微腔结构，以80～120μm的相邻间距呈阵列依次分布，每个直线通道上的圆柱体微腔结构的数量随通道B直线通道的长度而变化。圆柱体微腔结构中心轴垂直于微流控芯片及通道B直线通道的底部，并与所在的通道B直线通道流体方向垂直；每个圆柱体微腔结构通过底部的矩形小通道连接到通道B直线通道。优选的，通道B的圆柱体微腔结构的直径为80～200μm，深度为80～200μm。所述的矩形小通道长度30～40m，深度30～40μm。本发明的一个优选实施例中，微流通道单元的数量为6个，呈环形阵列排布。通道A和通道B的深度为100μm，宽度1mm。进样口I、进样口II和出样口的直径为1mm；以通道A的顶部为基准，鱼骨的深度为35μm，宽度35μm；同组鱼骨形结构单元中，相邻鱼骨的间距为100μm，即同一直线通道上，相邻的鱼骨形结构单元的之间的最短距离为100μm；每组鱼骨形结构单元包括10个鱼骨，鱼骨的侧壁A和侧壁B之间夹角为90度，与通道A两侧的夹角分别为45度；同一直线通道上或者流体前进方向上，鱼骨形结构单元侧壁A和侧壁B的长度以1:2和2:1的比例间隔分布。通道B中圆柱体微腔结构的直径为100μm，深度100μm，相邻圆柱体微腔结构的间距为100μm；矩形小通道的深度为35μm，宽度为35μm。优选的，所述的通道A内修饰巯基。进一步，所述的通道A内连接DNA四面体，且DNA四面体的一个顶点上连接上用生物素修饰，并含有酶切位点序列；DNA四面体的其余至少一个顶点上用酰胺类修饰，并通过迈克尔加成反应使DNA四面体固定在通道A的内表面。优选的，DNA四面体的三个顶点上用丙烯酰胺修饰，一个顶点上用生物素修饰，并含有酶切位点序列。丙烯酰胺与通道A内的巯基发生的迈克尔加成反应，将DNA四面体固定在通道内表面。进一步，将识别捕获目标细胞的特异性适配体序列aptamer序列用生物素修饰，并通过亲和素固定在修饰有生物素的DNA四面体顶点上，实现DNA四面体-亲和素-适配体结构的构建，将特异性适配体的序列连接到通道A内表面。在用生物素修饰的DNA四面体顶点上设置酶切位点序列，或者在特异性适配体序列上含有酶切位点序列。优选的，在特异性适配体序列上含有酶切位点序列。所述的酶切位点序列为限制性内切酶序列，选自EcoRI、EcoRV、BamHI、HindIII、XbaI、SalI、SacI、SacII、XhoI、NcoI等。一种快速捕获或检测细胞的方法，使用上述微流控芯片，步骤包括：1将待测的样品液从进样口I处加入，在进样口II给予负压以实现进样，并吸出废液，目标细胞被通道A上的适配体捕获；2目标细胞被捕获后，负压条件下，将DNA酶从进样口I处加入到通道A内并孵育进行酶切，从通道A修饰序列的酶切位点处切开，以释放被捕获的目标细胞；3出样口给予负压处理后，打开进样口II和出样口，目标细胞被释放后随酶切液流入进样口II和出样口之间通道B内两侧的圆柱体微腔结构中，进行富集。步骤1中，先将识别目标细胞上的适配体序列连接到通道A的内表面。所述的酶选自EcoRI、EcoRV、BamHI、HindIII、XbaI、SalI、SacI、SacII、XhoI、NcoI。所述的DNA四面体总长度为80～200bp，优选为100～120bp。步骤1～3中，真空度为-0.05～-0.08Mpa，优选为-0.06～-0.07Mpa。步骤3中，施加负压的时间为10～60s，优选为20～40s。检测圆柱体微腔结构中的细胞可以鉴别样品中是否含有目标细胞。或者，向通道B内加入细胞培养基进行孵育培养，观测圆柱体微腔结构中的细胞，以确定样品中是否含有目标细胞。经过步骤3处理后，负压条件下，向通道B内加入细胞培养基并孵育。负压条件真空度为-0.05～-0.08Mpa，优选为-0.06～-0.07Mpa。所述的目标细胞为微生物或肿瘤细胞。优选的，所述的肿瘤细胞为循环肿瘤细胞，包括乳腺癌循环肿瘤细胞、肺癌循环肿瘤细胞、肝癌循环肿瘤细胞、宫颈癌循环肿瘤细胞、或者前列腺癌循环肿瘤细胞。优选的，所述的微生物为细菌或真菌，尤其是致病性微生物，例如致病性细菌，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血性链球菌、沙门氏菌、肺炎链球菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、李斯特菌、幽门螺旋杆菌、布氏杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌等。本发明的微流控芯片级以及检测方法，可实现目标细胞，例如肿瘤细胞或微生物细胞的特异捕获、检测、释放和富集培养，减少目标细胞在捕获过程中的损伤，提高检测的灵敏度和特异性，实现快速检测。尽管近年来细胞的快速检测技术得到迅速的发展，但要实现快速，灵敏，低成本的检测还存在很大的局限性。因此，本发明提供了一种用于细胞快速检测的微流控芯片，将鱼骨形结构与微腔结构结合，芯片中的鱼骨形结构可以打破流体在蛇形通道内流动、低雷诺数时的层流状态，产生垂直流，使流线呈现出一种螺旋的形态，从而有利于流体在通道内的混合混匀；微流控芯片“蛇形”通道进样口I到进样口II部分首先进行表面巯基修饰，DNA四面体的三个顶点修饰有丙烯酰胺，丙烯酰胺与PDMS通道内的巯基发生迈克尔加成反应，DNA四面体因此固定在通道表面；另一个顶点为生物素修饰，通过亲和素连接有生物素修饰的能捕获目标细胞的特异性aptamer，实现DNA四面体-亲和素-aptamer结构的构建，并且aptamer上含有酶切位点序列。DNA四面体的存在提供了空间和静态障碍，大大提高aptamer与目标分子的杂交效率，使其更好的在表面上沿直立方向组织，其横向间距和相互作用可以通过DNA四面体的大小进行定量调节；芯片中鱼骨形结构的存在增加了细胞和DNA四面体-亲和素-aptamer结构修饰的壁面之间的碰撞几率，降低了细胞所受的剪切力，较好的维持了被捕获目标细胞的细胞活力，增加了细胞捕获率，减少了在捕获过程中对目标细胞造成的不可逆损伤。目标细胞被捕获后，在进样口I处将DNA酶加入到芯片通道中，控制作用温度和时间，在酶切位点处将aptamer序列切开，封住进样口II，被捕获的细胞得到释放，随酶切液流向进样口II和出样口之间通道两侧的微腔结构中，实现细胞的富集，可进行检测和体外培养。本发明通过将鱼骨形结构与微腔结构结合，将细胞从捕获到培养系统化，实现了目标细胞例如食源性致病菌或肿瘤循环细胞的高效、低成本、高灵敏度、高特异性捕获、检测、释放和富集，将鱼骨形结构和圆柱体微腔结构结合，提高了细胞的捕获和体外增殖效率，将捕获的细胞富集到很小体积的微腔结构中，进一步提高了体外培养的存活率，实现了样品中目标细胞有效的体外扩增，从而为进一步实现细胞的分子分析和功能性研究奠定了基础。附图说明图1为微流控芯片的设计图图2为微流控通道单元的设计图图3为不带有鱼骨形结构单元和圆柱体微腔结构的蛇形通道示意图图4为通道A的鱼骨形结构单元俯视图图5为带有鱼骨形结构单元通道A纵剖面图图6为通道B的圆柱体微腔结构俯视图图7为通道B圆柱体微腔结构在图6C-C’方向上的视图图8为实施例1的通道B圆柱体微腔结构的示意图A和通道A上鱼骨形结构单元的示意图B图9为实施例3中，单个圆柱体微腔结构内细胞的荧光检测图图10实施例3中，加入不同浓度细胞悬液检测后，单个圆柱体微腔结构内的明场和荧光检测结果图11实施例3中，经过富集的细胞经过0～18小时培养的结果1—通道A，101—鱼骨形结构单元，102—鱼骨，103—鱼骨间隙，104—鱼骨微槽A，105—鱼骨微槽B，107—通道A直线通道，108—通道A弧形通道，2—通道B，201—圆柱体微腔结构，202—矩形小通道，207—通道B直线通道，208—通道B弧形通道，3—微流通道单元，4—进样口I，5—进样口II，6—出样口。具体实施方式实施例1如图1所示，在微流控芯片上分布6组相同的微流控单元，呈环状阵列排布。微流控单元的设计图如图2所示，结构包括相互连接的通道A和通道B，通道A和通道B为蛇形通道，截面为矩形；不带鱼骨形结构单元和圆柱体微腔结构的蛇形通道如图3所示。通道A和通道B均为蛇形，包括直线通道和弧形通道；且两者的直线通道相互平行排布；每条直线通道长度不等，并且自微流控芯片的中心向外，直线通道长度逐渐增加；通道B的直线通道长度均小于通道A的直线通道长度。通道A的直线通道之间相互平行，且相邻的通道A直线通道107间以通道A弧形通道108相连接；通道B的直线通道之间相互平行，且相邻的通道B直线通道207间以通道B弧形通道208相连接。通道A的一端开设有进样口I，进样口I位于微流控芯片的外侧；通道A与通道B的连接处设有进样口II，通道B的末端为出样口，出样口位于微流控芯片的内侧位置。进样口II位于连接通道A和通道B的弧形通道上。通道A和通道B的深度为100μm，宽度1mm。进样口I、进样口II和出样口的直径为1mm。如图3、4所示，通道A内设有多组鱼骨形结构单元；所述的鱼骨形结构单元位于通道A的直线通道内的顶部。每组鱼骨形结构单元包括10相互平行的鱼骨，相邻的鱼骨之间形成鱼骨间隙。鱼骨的结构包括鱼骨微槽A和鱼骨微槽B，鱼骨微槽A和鱼骨微槽B与通道A直线通道107的夹角分别为45度，鱼骨微槽A与鱼骨微槽B之间的夹角为90度；鱼骨微槽A与鱼骨微槽B的长度不相等，长度比例为1:2或2:1。同一直线通道上或者流体前进方向上鱼骨微槽A和鱼骨微槽B的长度以1:2和2:1的比例间隔分布。鱼骨的方向与流体的流动方向相同，如图4所示。鱼骨的宽度为35μm；以通道A的顶部为基准，鱼骨向上凹陷，深度为35μm；鱼骨间隙的下方到通道A底部的距离为100μm。如图5、图8B所示。同组鱼骨形结构单元中，相邻鱼骨的间距即鱼骨间隙的宽度为100μm，同一直线通道上，相邻的鱼骨形结构单元的之间的最短距离为100μm，即相邻鱼骨形结构单元的侧壁A或侧壁B之间的最短间距为100μm。如图6、7、8A所示，通道B内设有圆柱体微腔结构，每一个通道B直线通道的两侧内壁上，圆柱体微腔结构直径100μm，以100μm的相邻间距呈阵列依次分布，每个直线通道上的圆柱体微腔结构的数量随通道B直线通道的长度而变化；圆柱体微腔结构中心轴垂直于微流控芯片及通道B直线通道的底部，并与所在的通道B直线通道流体方向垂直；每个圆柱体微腔结构通过其底部矩形小通道202与通道B直线通道相连通。矩形小通道的宽度35μm、长度60μm、深度35μm。实施例2在实施例1微流控芯片的各微流控单元的进样口I和进样口II之间的通道A内先用3-甲氧基巯基丙基硅烷进行表面巯基修饰，构建总长度100bp的DNA四面体结构，并在其中三个顶点上修饰丙烯酰胺，通过丙烯酰胺与通道A内的巯基发生的迈克尔加成反应，将DNA四面体固定在通道内表面。DNA四面体的另一个顶点上用生物素修饰。实施例3选择能够特异性识别大肠杆菌O157:H7细胞的aptamer序列，并通过亲和素-生物素实现DNA四面体-亲和素-aptamer结构的构建，将能够捕获大肠杆菌O157:H7细胞的aptamer序列连接固定在通道A的内表面。aptamer序列上含有EcoRI酶切位点。取大肠杆菌O157:H7细胞进行荧光染色，重悬于pH＝7.4的磷酸缓冲液中，分别配制成107、106、105、104、103、102CFUmL的混合液。打开进样口II并给予-0.06Mpa真空度的负压条件下，将100μL含有大肠杆菌O157:H7细胞的细胞悬液从进样口I缓慢通入微流控芯片，实现进样和吸出废液，目标细胞被通道A内的aptamer序列识别并捕获。目标细胞捕获后，-0.06Mpa真空度的负压条件下，将EcoRI的酶切缓冲液从进样口I加到通道A中，封住进样口II并在37℃下孵育1h，在酶切位点处将aptamer序列切下来，被捕获的大肠杆菌细胞从通道A上释放。在出样口给予-0.06Mpa真空度的负压，处理约30s；酶切液在-0.06Mpa真空度条件下流入通道B，大肠杆菌随酶切液流入通道B两侧的圆柱体微腔结构中，从而被富集，可以用于进行检测。大肠杆菌O157:H7细胞的细胞悬液含量为107CFUmL时，圆柱体微腔结构中的荧光检测结果如图9所示。可以看到，目标细胞富集于通道B的微腔结构内，根据进样量统计，富集效果约80％。图10为不同浓度大肠杆菌O157:H7细胞的细胞悬液的检测结果，A1～F1为显微镜明场图，A2～F2为荧光显微镜下的结果。A～F的细胞悬液浓度分别为107CFUmL、106CFUmL、105CFUmL、104CFUmL、103CFUmL、102CFUmL。浓度为102mL时，富集率约为70％，其他浓度下，富集率为70％～80％。由图10可知，进样量100μL时，检测限可以达到100CFUmL。取浓度为104CFUmL大肠杆菌悬液，用上述方法捕获并酶切后，封住进样口II，在出样口施加负压30s、真空度-0.06Mpa，被捕获的大肠杆菌被富集到微腔结构中。打开进样口II，从进样口II向芯片的通道B中加入细胞培养基，使培养基流入通道B两侧的圆柱体微腔结构。在37℃下培养0～18小时，结果如图11所示。结果表明，使用上述芯片以及方法，经过可将捕获的的微生物于微腔结构中富集，并且可以进行体外培养，生长良好，说明使用上述芯片和方法，目标细胞的损伤小，可以提高目标细胞体外培养的存活率和体外扩增效率。或者后续进行收集并体外培养如将实施例1的微流控芯片上鱼骨方向设置为与流体流动方向相反，以上实施例的捕获、富集和检测细胞的结果没有明显差异。EcoRI限制性内切酶及其酶切位点可以用其他限制性内切酶例如BamHI、HindIII等代替，效果不变。实施例4本实施例中，以金黄色葡萄球菌及能够特异性识别金黄色葡萄球菌的aptamer序列，代替实施例6中的目标细胞大肠杆菌O157:H7及其特异性aptamer序列，结果显示，富集率70％～80％，并且经过富集的微生物能够在微腔结构中进行培养。实施例5本实施例中，以沙门氏菌细胞及能够特异性识别沙门氏菌的aptamer序列，代替实施例6中的目标细胞大肠杆菌O157:H7及其特异性aptamer序列，结果显示，富集率70％以上，并且经过富集的微生物能够在微腔结构中进行培养。实施例6本实施例中，用副溶血性弧菌细胞以及能够特异性识别副溶血性弧菌的aptamer序列，代替实施例6中的目标细胞大肠杆菌O157:H7及其特异性aptamer序列，结果显示，富集率70％以上，并且经过富集的微生物能够在微腔结构中进行培养。实施例7本实施例中，用溶血性链球菌细胞以及能够特异性识别溶血性链球菌的aptamer序列，代替实施例6中的目标细胞大肠杆菌O157:H7及其特异性aptamer序列，结果显示，富集率70％以上，并且经过富集的微生物能够在微腔结构中进行培养。实施例8选择能够特异性识别乳腺癌CTCs细胞的aptamer序列，并通过亲和素-生物素实现DNA四面体-亲和素-aptamer结构的构建，将能够捕获乳腺癌CTCs细胞的aptamer序列连接固定在通道A的内表面。aptamer序列上含有EcoRI酶切位点。取乳腺癌CTCs细胞进行荧光染色，并与健康人血液混合，然后裂解红细胞并将剩余细胞重悬于pH＝7.4的磷酸缓冲液中。打开进样口II并给予-0.06Mpa真空度的负压条件下，将200μL含有乳腺癌CTCs的细胞悬液200个细胞mL从进样口I缓慢灌注入微流控芯片，实现进样和吸出废液，目标细胞被通道A内的aptamer序列识别并捕获。目标细胞捕获后，-0.06Mpa真空度的负压条件下，将EcoRI的酶切缓冲液从进样口I加到通道A中，封住进样口II并孵育，在酶切位点处将aptamer序列切下来，被捕获的乳腺癌CTCs细胞从通道A上释放。在出样口给予-0.06Mpa真空度的负压，处理约30s；酶切液在-0.06Mpa真空度条件下流入通道B，乳腺癌CTCs细胞随酶切液流入通道B两侧的圆柱体微腔结构中，从而被富集，可以直接检测，或者后续进行收集并体外培养。荧光检测结果如图所示，目标细胞富集于通道B的微腔结构内。根据进样时的细胞数量进行统计，富集效果可以达到70％以上。实施例9用肝癌CTCs细胞及能够特异性识别肝癌CTCs细胞的aptamer序列代替实施例8的乳腺癌CTCs细胞及特异性aptamer序列，结果显示，富集效果超过70％。富集后的细胞进行体外培养，实施例10用肺癌CTCs细胞及能够特异性识别肝癌CTCs细胞的aptamer序列代替实施例8的肺癌CTCs细胞及特异性aptamer序列，结果显示，富集效果超过70％。

权利要求：1.一种用于快速捕获或检测细胞的微流控芯片，其特征在于，其结构包括至少一组微流控单元，微流控单元的数量为4～8组，呈环形阵列排布；每组微流控单元的结构包括相互连接的通道A和通道B，通道A和通道B为蛇形通道；包括直线通道和弧形通道。通道A和通道B的直线通道相互平行排布，相邻的直线通道的通过弧形通道相连；通道A的一端开设有进样口I，进样口I位于微流控芯片的外侧；通道A与通道B的连接处设有进样口II，通道B的末端为出样口，出样口位于微流控芯片的内侧位置；通道A和通道B的深度为80～200μm，宽度0.8～1.5mm；通道A内设有多组鱼骨形结构单元；所述的鱼骨形结构单元位于通道A的直线通道内的顶部；每组鱼骨形结构单元包括多个相互平行的鱼骨；每组鱼骨形结构单元包括6～12个鱼骨，以通道A的顶部为基准，鱼骨的深度为30～50μm，宽度为30～50μm；同组鱼骨形结构单元中，相邻鱼骨的间距为80～120μm；鱼骨的结构包括鱼骨微槽A和鱼骨微槽B，鱼骨微槽A和鱼骨微槽B与通道A直线通道的夹角分别为30～60度，鱼骨微槽A与鱼骨微槽B之间的夹角为80～100度；鱼骨微槽A与鱼骨微槽B的长度不相等；所有鱼骨的方向与流体的流动方向相同或相反；同一直线通道上、流体前进方向上，鱼骨形结构单元鱼骨微槽A和鱼骨微槽B的长度以1:1.8～2.1和1.8～2.1:1的比例间隔分布；同一直线通道上，相邻的鱼骨形结构单元的之间的最短距离为80～120μm；通道B内设有微腔结构，所述的微腔结构位于通道B的直线通道内壁的两侧。所述的微腔结构为圆柱体微腔结构，以80～120μm的相邻间距呈阵列依次分布，每个直线通道上的圆柱体微腔结构的数量随通道B直线通道的长度而变化；每个圆柱体微腔结构通过底部的矩形小通道连接到通道B直线通道。通道B的圆柱体微腔结构的直径为80～200μm，深度为80～200μm。2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述的圆柱体微腔结构中心轴垂直于微流控芯片及通道B直线通道的底部，并与所在的通道B直线通道流体方向垂直；所述圆柱体微腔结构的直径为100μm，相邻圆柱体微腔结构的间距为100μm；矩形小通道的深度为35μm，宽度为35μm。3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述通道A和通道B的深度为100μm，宽度1mm；进样口I、进样口II和出样口的直径为1mm；鱼骨的宽度为35μm，以通道A的顶部为基准，鱼骨的高度为35μm；同组鱼骨形结构单元中，相邻鱼骨的间距为100μm；同一直线通道上，相邻的鱼骨形结构单元的之间的最短距离为100μm；每组鱼骨形结构单元包括10个鱼骨，鱼骨的鱼骨微槽A和鱼骨微槽B之间夹角为90度，与通道A两侧的夹角分别为45度；同一直线通道上或者流体前进方向上，鱼骨形结构单元鱼骨微槽A和鱼骨微槽B的长度以1:2和2:1的比例间隔分布；所述微流控单元的数量为6组。。4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述的通道A内修饰巯基。5.根据权利要求1或所述的微流控芯片，所述的通道A内连接DNA四面体，且DNA四面体的一个顶点上用生物素修饰；DNA四面体的其余至少一个顶点上用酰胺类修饰，并通过迈克尔加成反应使DNA四面体固定在通道A的内表面。6.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，将识别捕获目标细胞的特异性适配体序列通过亲和素固定在修饰有生物素的DNA四面体顶点上，将特异性适配体的序列连接到通道A内表面。7.根据权利要求5或6所述的微流控芯片，所述的DNA四面体用生物素修饰的顶点、或者特异性适配体的序列上带有DNA限制内切酶位点。8.根据权利要求7所述的微流控芯片，所述DNA限制内切酶选自EcoRI、EcoRV、BamHI、HindIII、XbaI、SalI、SacI、SacII、XhoI、NcoI。9.一种快速捕获或检测细胞的方法，其特征在于，使用权利要求1～8任一项所述的微流控芯片，步骤包括：1将待测的样品液从进样口I处加入，在进样口II给予负压以实现进样，并吸出废液，目标细胞被通道A上的适配体捕获；2目标细胞被捕获后，将DNA限制性内切酶从进样口I处加入到通道A内，从通道A修饰序列的酶切位点处切开，以释放被捕获的目标细胞；3封住进样口II并打开出样口，目标细胞被释放后随酶切液流入进样口II和出样口之间通道B内两侧的圆柱体微腔结构中，进行富集。10.根据权利要求9所述快速捕获或检测细胞的方法，经过步骤3处理后，向通道B内加入细胞培养基并孵育。

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