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申请/专利权人：中国水产科学研究院珠江水产研究所;广州瑞科基因科技有限公司

摘要：本发明属于基因检测技术领域，公开了一种适用于ZWXY性别决定系统的性别特异标记检测方法，使用全基因组高通量测序策略，结合基因组组装技术、双端测序数据精细比对技术和特征序列检测技术，识别性别特异标记；通过基因组组装，获得雌性与雄性基因组序列，并根据序列比对结果，分析雌性与雄性基因组序列间的序列特征，检测分析与鉴定性别相关联的基因组序列。本发明采用全基因组高通量测序策略实现了稳定、灵敏、特异、高效的性别标记检测分析，操作简单，突变率低，耗时短，且对平台要求较低。由本发明的测序深度与覆盖度关系可知，当测序深度在32倍时，基因组覆盖率超过90％；当测序深度在43倍时，基因组覆盖率超过95％。

主权项：1.适用于ZWXY性别决定系统的性别特异标记检测方法，其特征在于，包括：第一步，构建数学模型，通过计算机模拟获得第一轮和第二轮筛选中合适的样本数；第二步，确定使用3雌3雄的样本组合进行第一轮性别特异性标记的筛选；第三步，确定为ZW性别决定系统后，选取包含30个雄性中华鳖个体的混池进行测序和第二轮比对；第四步，PCR的初步验证，群体验证和胚胎验证，来确定性别特异性标记的准确性；具体包括：S1，确定雌性样品和雄性样品的基因组测序，基于雌性样品和雄性样品的全基因组测序数据，初步判定待研究物种属于基因决定型性别控制机制GSD，还是环境决定型性别控制机制ESD；S2，检测雌性和雄性特异的基因组DNA序列，若初步判定为基因决定型性别决定机制，则进一步判定属于XY型性别决定机制或ZW型性别决定机制；S3，批量采集雌性样品与雄性样品，若属于XY型性别决定机制，则对采集的雌性样品提取DNA并等量混合后测序，去除假阳性的Y特异序列；若属于ZW型，则对应选择雄性样品混合测序，去除假阳性的W特异序列；S4，设计引物并确定PCR反应条件；根据混合样品测序数据，筛选确认YW特异序列；组装XY，ZW染色体序列，获得性染色体；S1中的基因组测序包括：提取雌性和雄性样品的基因组DNA后，构建插入片段大小为500bp的双末端基因组DNA文库；采用Illumina测序平台进行测序，测序策略为PairEnd150bp，测序量为基因组大小的30倍；S4中，对于通过第一次样品组合，并结合PCR实验符合XY型或ZW型的物种，在第二轮实验验证中仅需要验证第一轮筛选得到的分子标记是否在更广泛的群体中也符合；采用不加Index的混池结合高通量测序的方法进行，由于没有Index区分，ZW的雌性样品和XY的雄性样品不适合用于混池筛选，仅选择ZW的雄性样品和XY雌性样品进行混池标记错误率PEPool的计算；采用PrimerPremier5软件设计引物，引物设计在特异序列区，包括引物P44F的核苷酸序列为SEQIDNO:1，引物P44R的核苷酸序列为SEQIDNO:2；引物PB1F的核苷酸序列为SEQIDNO:3，引物PB1R的核苷酸序列为SEQIDNO:4；S4中的PCR反应体系为20μL，包括2*TaqMasterMixDye10μL，10μMPrimerF0.8μL；10μMPrimerR0.8μL，DNA模板1μL；H2O7.4μL；PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，51℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min；采用1%浓度琼脂糖电泳进行检测，DNAMarker：DM2000，由6条DNA片段组成，分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，胶图中DNAMarker标记为M；其中，750bp大小的DNA片段显示为亮带。

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