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申请/专利权人：云南民族大学

摘要：本发明公开了一种基于双足DNA步行器测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法；本发明提供的双足DNA步行器通过三条单链DNA探针杂交形成，其中一条DNA探针由发夹DNA经T4多聚核苷酸激酶磷酸化和核酸外切酶剪切产生；利用核酸内切酶驱动双足DNA步行器在电极表面行走，剪切释放轨道链中电化学活性DNA片段，实现响应信号放大；电化学放大响应信号与T4多聚核苷酸激酶浓度成正比，实现对T4多聚核苷酸激酶的高灵敏度和高选择性测定。本发明操作简单、成本低、非放射性、灵敏度高、选择性好。

主权项：1.一种基于双足DNA步行器的检测T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法，其特征在于包括如下步骤：（1）设计发夹DNA序列；所述的发夹DNA具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；（2）设计单链DNA探针B序列；所述的单链DNA探针B具有SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；（3）设计单链DNA探针C序列；所述的单链DNA探针C具有SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；（4）构建电化学生物传感器：T4多聚核苷酸激酶催化发夹DNA末端-OH基团磷酸化，之后被核酸外切酶剪切产生单链DNA探针A；然后三条单链DNA探针A、B和C杂交，形成双足DNA步行器；以核酸内切酶Nb.BbvCI驱动双足DNA步行器在轨道链DNA修饰的电极表面行走，剪切释放轨道链中的电化学活性的轨道链DNA片段，实现电化学响应信号放大和T4多聚核苷酸激酶活性测定；所述的轨道链DNA具有SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；（5）测定T4多聚核苷酸激酶活性；测定T4多聚核苷酸激酶T4PNK活性：使用电化学工作站以三电极体系进行测试，采用微分脉冲伏安法DPV进行定量，绘制DPV峰电流与T4PNK浓度关系的标准曲线；（6）测定T4多聚核苷酸激酶抑制剂；（7）实际样品测定；其中，所述的发夹DNA的长度为36个碱基，5'端标记羟基；所述的单链DNA探针B的长度为55个碱基，5'端7个碱基可被核酸内切酶剪切；所述的单链DNA探针C的长度为55个碱基，5'端7个碱基可被核酸内切酶剪切；所述的轨道链DNA的长度为15个碱基，5'端标记二茂铁Fc，3'端标记巯基。

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