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申请/专利权人：河北医科大学第四医院(河北省肿瘤医院)

摘要：本发明公开了KMT2A基因突变对食管鳞癌治疗抵抗影响的研究方法，涉及基础医学技术领域，包括临床标本的收集和检测的步骤、KMT2A对食管鳞癌细胞功能的影响研究步骤和动物实验验证KMT2A对食管鳞癌放免联合治疗的影响步骤。通过本发明提供的方法掌握食管鳞癌患者在接受治疗过程中的不同时间节点获取的ctDNA‑MRD动态变化值，发现在诱导治疗阶段即可预测食管鳞癌全程治疗后患者的预后及其与ctDNA‑MRD动态变化的相关性，利用ctDNA突变图谱所反应的食管鳞癌患者接受免疫联合治疗过程中ctDNA的突变规律及其与患者治疗预后的关系，明确MRD检测早于临床上影像学检查结果所提示的患者疾病进展的具体预警时间，KMT2A基因突变影响食管鳞癌细胞治疗抵抗的分子作用机制。

主权项：1.KMT2A基因突变对食管鳞癌治疗抵抗影响的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、临床标本的收集和检测：S11、选择临床上经组织病理学确诊为II-III期不适合手术的食管鳞癌患者，给予新辅助免疫联合化疗治疗+免疫联合放化疗根治性治疗+免疫巩固性治疗；S12、治疗前采集患者食管癌实体肿瘤组织标本，同时采集血液样本进行ctDNA-MRD检测，以及T细胞免疫组库检测；S13、治疗期间采集患者血液样本进行ctDNA-MRD检测；S14、治疗后采集患者血液样本进行ctDNA-MRD检测；S15、随访期间采集患者血液样本进行ctDNA-MRD检测，按临床需求进行胸腹部CT、食管造影和或电子胃镜等影像学和病理学检查；S16、对组织标本和血液样本进行ctDNA进行NGS检测；S2、KMT2A对食管鳞癌细胞功能的影响研究：S21、构建KMT2A特异性突变食管鳞癌细胞系，采用系列实验技术方法进行验证；S22、将KMT2A特异性突变食管鳞癌细胞、KMT2A野生型食管鳞癌细胞分别与外周血单核细胞以一定比例共培养之后，检测癌细胞存活率，tSNE检测共培养之后不同免疫细胞分型分布情况，分析KMT2A特异性突变对食管鳞癌肿瘤微环境中免疫细胞分布的影响；S23、质谱分析和Co-IP实验寻找KMT2A相互作用靶点，分析KMT2A与CREBBP可能的相互作用机制，在KMT2A突变型、野生型的食管鳞癌细胞株中，改变CREBBP表达水平后，功能实验检测食管鳞癌细胞增殖、侵袭、迁移能力变化以及放化疗敏感性、免疫微环境的改变，观察改变CREBBP表达水平是否可逆转KMT2A突变诱导的治疗抵抗现象；S24、使用基因集富集分析和Metascape进行通路分析，CREBBP可能通过激活HIF-1信号通路调控VEGF、EGF、TIMP-1等影响肿瘤血管生成过程，进而引起食管鳞癌细胞治疗敏感性的变化，应用WesternBlotting实验观察敲低或过表达CREBBP后HIF-1信号通路相关蛋白及VEGF、EGF、TIMP-1表达变化，分析KMT2A通过与CREBBP相互作用调控HIF-1VEGF信号通路进而影响肿瘤血管生成，最终导致治疗抵抗的产生的分子机制；S3、动物实验验证KMT2A对食管鳞癌放免联合治疗的影响：S31、构建免疫系统人源化的huHSC-NOG-EXL小鼠模型；S32、取出瘤组织，部分瘤组织进行免疫组化检测，观察KMT2A及其它相关调节蛋白的表达情况，并对不同组移植瘤各种蛋白的表达变化结果进行比较；流式细胞术对比分析KMT2A突变型、野生型食管鳞癌细胞建立的异种移植瘤中免疫细胞分布情况；S33、将荧光素酶基因标记过的KMT2A突变型、野生型食管鳞癌细胞通过尾静脉注射入huHSC-NOG-EXL小鼠体内，建立肺转移瘤模型，应用小动物活体成像仪观察KMT2A突变对小鼠肺内转移瘤生长情况的影响。

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