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申请/专利权人：宾夕法尼亚大学董事会

摘要：本发明的名称是嵌合抗原受体‑修饰的T细胞治疗癌症的用途。本发明提供了治疗人癌症的组合物和方法。本发明包括涉及施用基因修饰的T细胞，以表达CAR，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。

主权项：1.包括慢病毒载体的T细胞，所述慢病毒载体包括编码嵌合抗原受体CAR的核酸序列，其中所述CAR由SEQIDNO:20的CD19抗原结合结构域、SEQIDNO:22的CD8α跨膜结构域、SEQIDNO:21的CD8α铰合结构域、SEQIDNO:23的4-1BB共刺激信号传导区和SEQIDNO:24的CD3ζ信号传导结构域组成，其中所述T细胞来自患有白血病的人，和其中所述T细胞是自体T细胞。

全文数据：嵌合抗原受体-修饰的T细胞治疗癌症的用途[0001]本申请是分案申请，原申请的申请日为2011年12月9日、申请号为201180067173XPCTUS2011064191、发明名称为“嵌合抗原受体-修饰的T细胞治疗癌症的用途”。[0002]相关申请的交叉引用[0003]本申请要求2010年12月9日提交的美国临时申请号61421,470和2011年6月29日提交的美国临时申请号61502，649的优先权，其全部在此通过引用全文并入。背景技术[0004]大部分具有B-细胞恶性肿瘤一一包括慢性淋巴细胞白血病CLL的患者，将死于他们的疾病。治疗这些患者的一个方法是基因修饰T细胞以通过嵌合抗原受体CAR的表达，靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。CAR为设计来以人白细胞抗原-非依赖性的方式识别细胞表面抗原的抗原受体。利用表达CAR的基因修饰细胞治疗这些类型患者的尝试已经得到非常有限的成功。见例如，Brentjens等，2010,MolecularTherapy，18:4,666_668;Morgan等，2010,MolecularTherapy，2010年2月23日在线公布，1-9页；和Till等，2008，Blood，112:2261-2271。[0005]在多数癌症中，肿瘤-特异性抗原还没有被很好地定义，但在B细胞恶性肿瘤中，⑶19是有吸引力的肿瘤标靶。CD19的表达限于正常和恶性B细胞Uckun等，Blood，1988,71:13-29，所以⑶19是安全测试CAR的广泛接受的标靶target。尽管CAR可以以类似于内源T-细胞受体的方式引发T-细胞活化，但至今对该技术的临床应用的主要阻碍已经限于CAR+T细胞的体内扩展、注入后细胞的快速消失和令人失望的临床活性Jena等，Bl〇〇d，2010，116:1035-1044;Uckun等，Blood，1988,71:13-29。[0006]因此，本领域迫切需要利用可体内扩展的CAR治疗癌症的组合物和方法。本发明解决了该需要。发明内容[0007]本发明提供了编码嵌合抗原受体CAR的分离的核酸序列，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3G信号传导结构域，其中CD3G信号传导结构域包括SEQIDNO:24的氨基酸序列。[0008]在一个实施方式中，核酸序列编码包括SEQIDNO:12的氨基酸序列的CAR。[0009]在一个实施方式中，编码CAR的核酸序列包括SEQIDNO:8的核酸序列。[0010]在一个实施方式中，CAR中的抗原结合结构域为抗体或其抗原-结合片段。优选地，抗原-结合片段为Fab或scFv。[0011]在一个实施方式中，CAR中的抗原结合结构域结合肿瘤抗原。在一个实施方式中，肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。在另一个实施方式中，肿瘤抗原与实体瘤相关。还在另一个实施方式中，肿瘤抗原选自〇19工020、022、1?01?1、间皮素11168〇他61111工03311^31^、3-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGEA3TCR和其任何组合。[0012]在一个实施方式中，CAR中的共刺激信号传导区包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自〇27、028、4-188、《40030、040、？〇-1、103、淋巴细胞功能相关抗原-ILFA-I、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与⑶83特异性结合的配体和其任何组合。[0013]在一个实施方式中，CAR中的⑶3ζ信号传导结构域由SEQIDNO:18的核酸序列编码。[0014]本发明也提供了分离的CAR，其包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和⑶3ζ信号传导结构域，其中⑶3ζ信号传导结构域包括SEQIDN0:24的氨基酸序列。[0015]本发明也提供了包括编码CAR的核酸序列的细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和包括SEQIDN0:24的氨基酸序列的CD3G信号传导结构域。[0016]在一个实施方式中，包括CAR的细胞选自T细胞、自然杀伤NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞CTL和调节T细胞。[0017]在一个实施方式中，当CAR的抗原结合结构域结合它相应的抗原时，包括CAR的细胞显示了抗肿瘤免疫。[0018]本发明也提供了包括编码CAR的核酸序列的载体，其中CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和CD3G信号传导结构域，其中CD3G信号传导结构域包括SEQIDN0:24的氨基酸序列。[0019]本发明也提供了刺激对哺乳动物中靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法。在一个实施方式中，该方法包括施用给哺乳动物有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQIDN0:24的氨基酸序列的CD3G信号传导结构域，其中选择抗原结合结构域以特异性识别靶细胞群或组织。[0020]本发明也提供了提供哺乳动物中抗肿瘤免疫的方法。在一个实施方式中，该方法包括施用给哺乳动物有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQIDN0:24的氨基酸序列的CD3G信号传导结构域，由此提供哺乳动物中的抗肿瘤免疫。[0021]本发明也包括治疗具有与升高的肿瘤抗原表达相关的疾病、紊乱或病症的哺乳动物的方法。在一个实施方式中，该方法包括施用给哺乳动物有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQIDNO:24的氨基酸序列的CD3G信号传导结构域，由此治疗哺乳动物。[0022]在一个实施方式中，细胞为自体T细胞。[0023]在一个实施方式中，肿瘤抗原选自019、020、0022、1?01?1、间皮素、003311^31^、3-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGEA3TCR和其任何组合。[0024]本发明也提供了治疗具有慢性淋巴细胞白血病的人的方法。在一个实施方式中，该方法包括施用给人基因工程改造以表达CAR的T细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQIDN0:24的氨基酸序列的CD3G信号传导结构域。[0025]在一个实施方式中，人对至少一种化疗剂具有抗性。[0026]在一个实施方式中，慢性淋巴细胞白血病为难治疗的⑶19+白血病和淋巴瘤。[0027]本发明也包括在诊断患有癌症的人中产生基因工程改造的T细胞的持续群的方法。在一个实施方式中，该方法包括施用给人基因工程改造的以表达CAR的T细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQIDN0:24的氨基酸序列的CD3G信号传导结构域，其中基因工程改造的T细胞的持续群在施用后，在人中持续至少一个月。[0028]在一个实施方式中，基因工程改造的T细胞的持续群包括至少一种选自以下的细胞:施用给人的T细胞、施用给人的T细胞的子代和其组合。[0029]在一个实施方式中，基因工程改造的T细胞的持续群包括记忆T细胞。[0030]在一个实施方式中，基因工程改造的T细胞的持续群在施用后，在人中持续至少三个月。在另一个实施方式中，基因工程改造的T细胞的持续群在施用后，在人中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、i^一个月、十二个月、两年或三年。[0031]在一个实施方式中，慢性淋巴细胞白血病被治疗。[0032]本发明也提供了在诊断患有癌症的人中扩展基因工程改造的T细胞群的方法。在一个实施方式中，该方法包括施用给人基因工程改造的以表达CAR的T细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、共刺激信号传导区和包括SEQIDN0:24的氨基酸序列的CD3G信号传导结构域，其中施用的基因工程改造的T细胞在人中产生子代T细胞群。[0033]在一个实施方式中，人中的子代T细胞包括记忆T细胞。[0034]在一个实施方式中，T细胞为自体T细胞。[0035]在另一个实施方式中，人对至少一种化疗剂具有抗性。[0036]在一个实施方式中，癌症为慢性淋巴细胞白血病。在另一个实施方式中，慢性淋巴细胞白血病为难治疗的CD19+白血病和淋巴瘤。[0037]在一个实施方式中，子代T细胞群在施用后在人中持续至少三个月。在另一个实施方式中，子代T细胞的群在施用后，在人中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。[0038]在一个实施方式中，癌症被治疗。附图说明[0039]当与附图结合阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的以下详细描述。为了说明本发明的目的，在附图中显示了目前优选的实施方式。然而，应当理解本发明不限于附图显示的实施方式的精确布置和手段。[0040]图1，包括图IA至1C，为基因转移载体和转基因、基因修饰的T细胞制造和临床方案设计的示意图的一系列图像。图IA描绘了显示主要功能元件的慢病毒载体和转基因。产生指导源于FMC63鼠科单克隆抗体的抗-CD19scFv、人CD8a铰合和跨膜结构域、和人4-1BB和CD3G信号传导结构域的表达的水泡性口炎病毒G蛋白假型临床等级慢病毒载体命名为pELPs19BBz。通过包括EF-Ia延伸因子-Ia启动子）；LTR，长末端重复;RRE，rev应答元件cPPT和中央终止序列CTS，指导转基因的组成型表达。图不是按比例的。图IB描绘了T细胞制造。自体细胞经单采血液成分术获得，和T细胞由单核细胞淘洗elutriation富集，冲洗，并且残余的白血病细胞通过添加抗-⑶3⑶28包被的顺磁珠用于阳性选择和活化T细胞而被耗尽。慢病毒载体在细胞活化时被添加，并在培养开始3天后被冲洗。细胞在摇动平台装置WAVEBioreactorSystem上扩展8-12天。在培养的最后一天中，通过经过磁场移除珠，并且收获CART19T细胞并在可注入的（infusible培养基中冷藏。图IC描绘了临床方案设计。给予患者如上所述的淋巴耗尽化疗，随后是在15-20分钟的时间期间内通过静脉内重力流滴注gravityflowdrip的CART19注入#1。在完成化疗后1至5天开始，利用在3天期间的分次剂量方法（10%、30%、60%提供注入。在研究第4周进行终点测定。在主动监测结束后，按照FDA指南，实验对象被转移至目的地协议，以长期跟踪。[0041]图2，包括图2A至2F，是显示CARTl9细胞的持续体内扩展以及血液和骨髓中持久性的一系列图像。如图2A至2C所描绘的从全血或如图2D至2F所描绘的从骨髓中分离的DNA，如图2A和2D所描绘的从UPN01、如图2B和2E所描绘的从UPN02和如图2C和2F所描绘的从UPN03获得的样本，利用合格测定（qualifiedassay成批经历Q-PCR分析，以检测和量化CART19序列。每个数据点代表对100-200ng基因组DNA三次测量值的平均，最大％CV小于1.56%。对于测定的通过失败参数包括扩增的斜率和效率的预定范围，和参考样本的扩增。由标准曲线范围建立的测定的定量下限为2个拷贝转基因微克的基因组DNA;在该数字以下的样本值被考虑为估计值并显示是否至少23复制产生了具有％^为值15%的Ct值。对于UPN01和UPN03，CART19细胞在第0、1和2天被注入，和对于UPN02，CART19细胞在第0、1、2和11天被注入。[0042]图3,包括图3A至3D，是显示以下的一系列图像:在CART细胞注入前后血清和骨髓细胞因子;在CARTl细胞注入后的指定天，如图3A所描绘的UPN01、如图3B所描绘的UPN02和如图3C所描绘的UPN03中血清细胞因子、趋化因子和细胞因子受体的改变的纵向测量值，和来自如图3D所描绘的UPN03的骨髓中相同分析物的系列评估。利用Luminex珠阵列技术和预组装并验证的多重试剂盒，使样本经历多重分析。具有多3倍变化的分析物被指示，并标绘为如图3A至3C所描绘的与基线的相对变化，或标绘为如图3D所描绘的绝对值。在每个时间点上每种分析物的绝对值源于在3-倍8-点稀释系列上的基于重组蛋白的标准曲线，通过标准曲线的80-120%实测期望的截断值确定定量的上限和下限UL0Q、LL0Q。每个样本一式两份进行评价，计算平均值，并且在多数情况下％CV小于10%。为了适应在绝对值的宽范围内容中的统一数据显示，对每种分析物，数据显示为相对于基线值的倍数-变化。在基线值是不可检测的情况下，最低标准曲线值的一半用作基线值。分析物的标准曲线范围和基线（第0天值对UPN01、02和03连续地在圆括号中列出）的单位都为pgml:ILl-Ra:35·5-29,318689、301、287;IL-6:2.7-4,5727、10.1、8.7;IFN-y:11.2-23,9722.8、ND、4.2;CXCLlO:2.卜5,319481、115、287;ΜΙΡ-1β:3.3-7，23399.7、371、174;MCP-1:4·8-3,600403、560、828;CXCL9:48.2-3,7001，412、126、177;IL2-Ra:13.4-34,2104，319、9,477、610;IL-8:2.4-5,27815.3、14.5、14.6;IL-10:6.7-13,8748.5、5.4、0.7;MIP-Ia:7.1-13,77857·6、57·3、48·I〇[0043]图4,包括图4Α至4D，是描绘了延长的表面CART19表达和体内功能记忆CAR的建立的一系列图像。图4A描绘了CAR-表达CD3+淋巴细胞的检测和外围和骨髓中B细胞的不存在。在CART19细胞注入后的第169天，从UPN03获得的新鲜处理的外周血或骨髓单核细胞通过流式细胞术对CAR19的表面表达顶部或B细胞的存在底部进行评价;作为对照，从健康捐赠者ND365获得的PBMC被染色。CD3+和B细胞群的设门策略gatingstrategy显示在图9中。为了评价CD3+淋巴细胞中的CAR19表达，样本与CD14-PE-Cy7和CD16-PE-Cy7泄放通道dumpchannel和⑶3-FITC的抗体进行共染色，对⑶3+阳性设门，并且通过与⑶8α-ΡΕ和与Alexa-647缀合的抗-CAR19个体基因型抗体的共染色评价⑶8+和⑶8-淋巴细胞区室中的CAR19表达。标绘图中的数据对泄放通道-阴性CD3-阳性细胞群设门。为了评价B细胞的存在，样本与对⑶14-APC和⑶3-FITC泄放通道）的抗体进行共染色，并通过与对⑶20-PE和⑶19-PE-Cy-7的抗体的共染色评价泄放通道-阴性部分中B细胞的存在。在所有情况中，阴性门象限被建立在非染色对照上，如图4B和4C所描绘的。显示了⑶4+图4B和⑶8+图4CT细胞亚型的T细胞免疫表型分析。在T细胞注入后第56和169天，通过单采血液成分术获得的来自UPN03的冷冻外周血样本在没有添加因子的培养基中静置过夜，冲洗，并经历用于表达T细胞记忆、活化和消耗的标记的多参数免疫表型分析。如图8所描绘的设门策略包括对泄放通道CD14、⑶16、LiveDeadAqua-阴性和⑶3-阳性细胞最初设门，随后对⑶4+和⑶8+细胞阳性设门。门和象限利用FMO对照CAR、CD45RA、PD-1、CD25、CDl27、CCR7或通过对阳性细胞群CD3、CD4、CD8和清楚描绘的亚型CD27、CD28、CD57设门建立;在对事件event的客观可视化的双指数转化后，显示数据。图4D描绘了持续CAR细胞的功能性能力functionalcompetence。在T细胞注入后第56和169天通过单米血液成分术获得的来自UPN03的冷冻外周血样本在没有添加因子的培养基中静置过夜，冲洗，并利用CD107脱粒测定直接离体评价识别⑶19-表达靶细胞的能力。在抗-CD28、抗-CD49d和⑶107-FITC的存在下两个小时的温育后，细胞混合物被收获、冲洗和经历多参数流式细胞检测分析，以评价响应⑶19-表达靶CART19细胞脱粒的能力。设门策略包括对泄放通道CD14-PE-Cy7、roi6-PE-Cy7、LiveDeadAqua-阴性和CD3-PE-阳性细胞的最初门，随后是对CD8-PE_TexasRed-阳性细胞设门；显示的数据是针对CD8+设门的群。在所有情况中，阴性门象限建立在非染色对照上。[0044]图5,包括图5A至5C，是系列图像，其描绘了CARTl细胞注入后评估临床应答的实验结果。图5A描绘了UPN02用两个周期的利妥昔单抗和苯达莫司汀以最小应答进行治疗RB，箭头）XART19T细胞在仅苯达莫司汀B，箭头后4天开始注入。耐利妥昔单抗和苯达莫司汀的白血病快速从血液中清除，如在注入的18天内，绝对淋巴细胞计数ALC从60，600μ1降低至200μ1所指示的。由于身体不适和非传染性发热综合征，皮质类固醇治疗在注入后的第18天开始。参考线（点线的）指示ALC的正常上限。图5Β描绘了针对CD20将来自患者UPN01和03的连续的骨髓活组织检查或凝块标本染色的实施例实验的结果。用存在于两个患者中的白血病的预处理浸润在处理后标本上不存在，伴随细胞构成和三系造血作用的正常化。UPN01没有检测到任何CLL细胞，如由流式细胞术、细胞遗传学和荧光原位杂交评估的，也没有在骨髓或血液中由流式细胞术检测到正常B细胞。UPN03在第+23天通过流式细胞术证实具有5%残余的正常CD5-阴性B细胞，其也显示它们为多克隆的；在第+176天未检测到正常B细胞。图5C描绘了利用连续CT成像评估耐化疗的普遍性淋巴结病的快速消散resolution的实验结果。双侧腋窝肿块axillarymass在注入后的第83UPN01和31UPN03天消散，如箭头和圆圈指示的。[0045]图6,包括图6A至6C，是一系列图像，其描绘了UPN01、02、03的循环中的绝对淋巴细胞计数和总CART19+细胞。利用来自CBC值的绝对淋巴细胞计数并假设5.OL体积的血液，对所有3个实验对象，绘制循环中淋巴细胞总数总的正常细胞和CLL细胞对总CART19+细胞的图。循环中的CART19细胞总数如下计算:通过利用串联CBC值与绝对淋巴细胞计数和Q-PCR标记值，如图2所描绘的，将拷贝数ngDNA转化为平均％标记，如本文其他地方所述的。发现Q-PCR%标记与注入产物的流式细胞术特性和来自其中伴随的流式细胞术数据可通过染色直接计数CART19细胞获得的样本数据紧密相关〈2倍变化）。[0046]图7,包括图7A至7D，是一系列图像，其描绘了涉及T细胞注入后71天，UPN-01PBMC中CART19-阳性细胞的直接离体检测的实验。在注入后第71天，单采血液成分术后新鲜收集或在用于制造T细胞产物基线）的单采血液成分术时冷冻并在染色前存活地解冻的UPN-01PBMC，经历流式细胞计数分析，以检测在表面上表达CAR19部分的CART19细胞的存在。为了评价CAR19在淋巴细胞中的表达，将样本与⑶3-PE和缀合至Alexa-647的抗-CAR19个体基因型抗体共染色，或与仅⑶3-PECAR19的FMO共染色。图7A描绘了最初的淋巴细胞门基于前向和侧向散射FSC对SSC，随后对CD3+细胞设门建立。图7B描绘了CD3+淋巴细胞门；图7C描绘了CAR个体基因型染色；图7D描绘了CAR个体基因型FMO。CAR19-阳性门建立在CARl9FM0样本上。[0047]图8,包括图8A至8C，是一系列图像，其描绘了在UPN03血液标本中通过使用多色流式细胞术鉴定CART19表达的设门策略。图8C的设门策略显示为针对UPN03第56天的样本，并为在UPN03第169天样本上使用的策略的代表。图8A描绘了初级门：DumpCD14、⑶16、LIVEdeadAqua阴性，⑶3-阳性。图8B描绘了次级门：CD4_阳性，⑶8阳性。图8C描绘了三级门：CAR19-阳性和CAR19-阴性，其建立在CARFMO样本最右图）上。[0048]图9描绘了直接鉴定血液和骨髓标本中的CART19表达和B细胞的设门策略。图4A的设门策略，其显示外周和骨髓中的CAR-表达CD3+淋巴细胞的检测和B细胞的缺失：左标绘图：细胞门；上图：CD3+细胞的阳性门；下图：B细胞的阴性门（CD14-阴性，CD3-阴性）。NC365:来自健康捐赠者的外周血对照细胞。[0049]图10为概括患者人口统计学特征和应答的图像。[0050]图11描绘了CART-19细胞的制造方法。[0051]图12,包括图12A至12D，为描绘了患者临床应答的一系列图像。图12A显示用于感染该患者T细胞的慢病毒载体。产生水泡性口炎病毒G蛋白（pELPsl9-BB-z的假型的、临床级慢病毒载体，其指导源于FMC63鼠科单克隆抗体的抗-CD19scFV、人CD8a铰合和跨膜结构域、和人4-1BB和⑶3ζ信号传导结构域的表达。在图12A底部的CAR19转基因的细节显示了主要的功能元件。该图不是按比例的。3’LTR指示3’长末端重复;5’LTR:5’长末端重复;AmpR:氨苄西林抗性基因；牛GHPolyA:具有多腺苷酸化尾的牛生长激素;cPPTCTS:具有中心终止序列的中心聚噪呤区;EF-Ia:延伸因子Ι-a;env:包膜;gag:群特异性抗原;pol:编码聚合酶和逆转录酶的HIV基因；R:重复；RRE:rev应答元件；scFv:单链可变片段；TM:跨膜；和WPRE:土拨鼠肝炎病毒后转录调节元件。图12B显示在首次CART19-细胞注入后从第1天至第28天的血清肌酸酐、尿酸和乳酸脱氢酶LDH水平。峰值水平与肿瘤溶解综合征的住院治疗同时发生。图12C显示在化疗后第3天第-1天，在CART19-细胞注入前和在CART19-细胞注入后第23天和第6个月获得的骨髓-活组织检查标本苏木精和曙红）。基线标本显示了具有三系造血作用的细胞过多骨髓60%，其由占总细胞构成40%的小的、成熟的淋巴细胞的占主导的间质聚集体浸润。第23天获得的标本显示对慢性淋巴白血病CLL为阴性的残余淋巴聚集体（10%，和T细胞和⑶5-阴性B细胞的混合物。注入后6个月获得的标本显示三系造血作用，没有淋巴聚集体和CLL继续缺失。图12D显示了在该患者被招入研究前和在首次注入后第31天和第104天获得的对比增强（照影增强）的CT扫描。注入前preinfusionCT扫描显示1至3-cm双侧肿块。腋淋巴结病的衰退发生在注入后1个月内并为持续性的。箭头强调在治疗前多种扩大的淋巴结和在治疗后可比CT扫描上的淋巴结应答。[0052]图13,包括图13A至13E，是一系列图像，其描绘了嵌合抗原受体T-细胞注入前后的血清和骨髓细胞因子。细胞因子干扰素-γ图13A、干扰素-γ-刺激的趋化因子C-X-C基序趋化因子10CXCLlO图13Β和C-X-C基序配体9CXCL9图13C和白细胞介素-6图13D的一系列测量值在指示的时间点上进行测量。这些炎性细胞因子和趋化因子的增加与肿瘤溶解综合征的开始同时发生。低水平的白细胞介素-6在基线上检测到，而干扰素-y、CXCL9和CXCLlO在基线上的检测限以下。患者中的分析物标准曲线范围和基线值一一提供在圆括号内——如下:干扰素-γ:11.2至23,972pg每毫升（1.4pg每毫升）；CXCL10:2.1至5319pg每毫升（274pg每毫升）；CXCL9:48·2至3700pg每毫升（177pg每毫升）；白细胞介素-6:2·7至4572?〖每毫升8.3?〖每毫升）；肿瘤坏死因子1的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可使用125或150XIO6细胞ml的浓度。使用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩展。进一步地，使用高细胞浓度允许更有效捕获可微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，诸如CD28-阴性T细胞，或捕获来自有很多肿瘤细胞存在的样本即白血病血液、肿瘤组织等）的细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并将期望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效选择正常具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。[0185]在相关的实施方式中，可期望使用更低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面例如，颗粒诸如珠的混合物，颗粒和细胞之间的相互作用被最小化。这选择表达高数量的结合至颗粒的期望抗原的细胞。例如，在稀浓度，CD4+T细胞比CD8+T细胞表达更高水平的CD28并更有效地被捕获。在一个实施方式中，使用的细胞浓度为5XIO6Ail。在其他实施方式中，使用的浓度可从大约IXIO5Ail至IXIO6Ail，和之间的任何整数值。[0186]在其他实施方式中，细胞可在旋转器上以变化的速度，在2_10°C或室温的任一个温度下温育变化的时间长度。[0187]在冲洗步骤后，用于刺激的T细胞也可被冷冻。不希望被理论所束缚，通过去除细胞群中的粒细胞和以一定程度去除单核细胞，冷冻和随后的解冻步骤提供了更均一的产物。在去除血浆和血小板的冲洗步骤后，细胞可被悬浮在冷冻液中。尽管很多冷冻液和参数在本领域中是已知的，并将在该背景下是有用的，但一个方法包括使用包含20%DMS0和8%人血清白蛋白的PBS，或包含10%葡聚糖40和5%右旋糖、20%人血清白蛋白和7.5%DMSO，或31.25%?1811^17丨6-4、31.25%右旋糖5%、0.45%他：1、10%葡聚糖40和5%右旋糖、20%人血清白蛋白和7·5%DMS0的培养基，或包含例如Hespan和PlasmaLyteA的其他合适的细胞冷冻培养基，细胞随后被以1°每分钟的速率冷冻至-80°C，并保存在液氮储罐的蒸汽相中。可使用受控冷冻的其他方法以及在-20°C下或液氮中不受控的即刻冷冻。[0188]在某些实施方式中，冷藏的细胞如本文所述的解冻和冲洗，并允许在使用本发明的方法活化前在室温下静止1个小时。[0189]在本发明的内容下也考虑到的是在当可能需要如本文所述的扩展细胞前的时间段上，从对象收集血液样本或单采血液成分术产物。如此，待扩展的细胞的来源可在必要的任何时间点收集，并且期望的细胞，诸如T细胞，被分离和冷冻，以便以后在T细胞疗法中用于将受益于T细胞疗法的任何数量的疾病或病症，诸如本文所述的那些。在一个实施方式中，血液样本或单采血液成分术样本取自大体健康的对象。在某些实施方式中，血液样本或单采血液成分术样本取自处于患病风险下但还没有患病的大体健康的对象，和感兴趣的细胞被分离和冷冻以便以后使用。在某些实施方式中，T细胞可在以后的时间被扩展、冷冻和使用。在某些实施方式中，如本文所述的具体疾病的诊断后立刻但在任何治疗前，从患者收集样本。在进一步的实施方式中，在任何数量的有关治疗形式前，从来自对象的血液样本或单采血液成分术样本分离细胞，所述治疗形式包括但不限于用以下治疗:试剂，诸如那他珠单抗natalizumab、厄法珠单抗efalizumab、抗病毒剂、化疗、福射radiation、免疫抑制剂，诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506,抗体或其他免疫烧蚀剂immunoablativeagent诸如CAMPATH、抗-CD3抗体、环磷酰胺（cytoxan、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇类、FR901228和照射（irradiation。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶一一钙调磷酸酶环孢菌素和FK506或抑制对生长因子诱导的信号传导雷帕霉素）重要的P70S6激酶（Liu等，Cel166:807-815，1991;Henderson等，Immun·73:316-321，1991;Bterer等，Curr·Opin·Immun·5:763-773，1993。在进一步的实施方式中，对患者分离细胞并冷冻以便以后与骨髓或干细胞移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法XRT、环磷酰胺或抗体诸如0KT3或CAMPATH的T细胞烧蚀疗法结合例如，之前、同时或之后使用。在另一个实施方式中，细胞被分离，然后可被冷冻以便以后在B-细胞烧蚀疗法诸如与⑶20反应的试剂例如Rituxan之后的治疗使用。[0190]在本发明的进一步实施方式中，在治疗后直接从患者获得T细胞。在这点上，已经观察到在某些癌症治疗后，特别是用损坏免疫系统的药物的治疗后，在治疗后不久当患者将正常地从治疗中恢复期间，获得的T细胞的质量对于它们的离体扩展能力可为最佳或改善的。同样的，在利用本文描述的方法离体操纵后，这些细胞可处于提高的移植物移入和体内扩展的优选状态。因此，在本发明的内容内考虑在该恢复期期间收集血液细胞，包括T细胞、树突细胞或造血系的其他细胞。进一步地，在某些实施方式中，转移例如，用GM-CSF转移和调节方案可用于在对象中产生病症，其中具体细胞类型的再群体化repopulation、再循环、再生和或扩展是有利的，特别是在疗法后限定的时间窗期间。说明性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其他细胞。[0191]T细胞的活化和扩展[0192]不论在T细胞遗传修饰以表达期望的CAR之前或之后，T细胞都可通常使用以下所述的方法活化和扩展：例如美国专利6，352，694;6，534，055;6，905，680;6，692，964;5，858，358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223;6,905,874;6,797,514;6,867,041;和美国专利申请公布号20060121005。[0193]通常地，本发明的T细胞通过与表面的接触进行扩展，所述表面具有附着于其的刺激CD3TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，T细胞群可如本文所述的诸如通过与固定在表面上的抗-CD3抗体、或其抗原-结合片段或抗-CD2抗体接触，或通过和与钙离子载体组合的蛋白激酶C激活剂例如，苔藓抑制素接触进行刺激。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群可在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗-CD3抗体和抗-CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，使用抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。可与在本领域中公知的其他方法一样，可使用包括9·3、B_T3、XR_CD28Diacione，Besancon,France的抗-CD28抗体的例子Berg等，TransplantProc.30⑻：3975-3977,1998;Haanen等，J.Exp.Med.1909:13191328,1999;Garland等，J.ImmunolMeth.2271-2:53-63,1999。[0194]在某些实施方式中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可在溶液中或连接至表面。当连接至表面时，试剂可被连接至同一表面（即，以“cis”形式或分开的表面（即，以“trans”形式）。可选地，一种试剂可被连接至表面和另一种试剂处于溶液中。在一个实施方式中，提供共刺激信号的试剂被结合至细胞表面，并且提供初级活化信号的试剂在溶液中或被连接至表面。在一些实施方式中，两种试剂可都在溶液中。在另一个实施方式中，试剂可处于可溶形式，随后被交联至表面，诸如表达Fc受体或抗体的细胞或将结合该试剂的其他结合剂。在这点上，见例如用于人造抗原呈递细胞aAPC的美国专利申请公布号20040101519和20060034810,其被考虑用于活化和扩展本发明的T细胞。[0195]在一个实施方式中，两种试剂被固定在珠上，在同一珠即“cis”上或分开的珠即“trans”上。作为例子，提供初级活化信号的试剂为抗-CD3抗体或其抗原-结合片段，和提供共刺激信号的试剂为抗-CD28抗体或其抗原-结合片段;并且两种试剂都以相等的分子数量被共固定至同一珠。在一个实施方式中，使用结合至用于CD4+T细胞扩展和T细胞生长的珠的1:1比率的每种抗体。在本发明的某些方面中，使用结合至珠的抗CD3:CD28抗体的比率，以便与利用1:1比率观察到的扩展相比，观察到T细胞扩展的增加。在一个具体的实施方式中，与利用1:1比率观察到的扩展相比，观察到从大约1至大约3倍的增加。在一个实施方式中，结合至珠的⑶3:⑶28抗体的比率处于100:1至1:100的范围中和其间的所有整数值。在本发明的一个方面中，比抗-CD3抗体更多的抗-⑶28抗体被结合至颗粒，S卩CD3:CD28的比率小于1。在本发明的某些实施方式中，结合至珠的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个具体的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:100的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:75的CD3:CD28比率。在进一步的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:50的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:30的CD3:CD28比率。在一个优选实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:10的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:3的CD3:CD28比率。还在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的3:1的⑶3:⑶28比率。[0196]从1:500至500:1和其间任何整数值的颗粒与细胞的比率可用于刺激T细胞或其他靶细胞。因为在本领域技术人员可容易地领会到，颗粒与细胞的比率可取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸的珠仅可结合一些细胞，而较大的珠能结合很多。在某些实施方式中，细胞与颗粒的比率在从1:100至100:1的范围内和其间任何整数值，和在进一步的实施方式中，该比率包括1:9至9:1和其间任何整数值，也可用于刺激T细胞。抗-⑶3-和抗-CD28-结合的颗粒与产生T细胞刺激的T细胞的比率可如以上记录的变化，然而某些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个优选的比率为至少1:1颗粒每T细胞。在一个实施方式中，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比率。在一个具体的实施方式中，优选的颗粒:细胞比率为1:5。在进一步的实施方式中，颗粒与细胞的比率可根据刺激天数而改变。例如，在一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在第一天为从1:1至10:1，和额外的颗粒每天或此后每隔一天直至10天，以从1:1至1:10的最终比率基于添加日的细胞计数被添加至细胞。在一个具体的实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为1:1并在刺激的第三和第五天被调节至1:5。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以在第一天最终比率为1:1，并在刺激的第三和第五天最终比率为1:5。在另一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为2:1并在刺激的第三和第五天被调节至1:10。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以在第一天最终比率为1:1，和在刺激的第三和第五天最终比率为1:10。本领域技术人员将理解多种其他比率可适于用于本发明。特别地，比率将根据颗粒大小和细胞大小和类型而变化。[0197]在本发明的进一步的实施方式中，细胞诸如T细胞，与包被试剂的珠组合，随后分离该珠和细胞，并且随后培养该细胞。在一个可选实施方式中，在培养前，不分离包被试剂的珠和细胞，而是在一起进行培养。在进一步的实施方式中，珠和细胞首先通过施加力诸如磁力被聚集，产生增加的细胞表面标记的连接作用，由此诱导细胞刺激。[0198]作为例子，可通过允许附接抗-⑶3和抗-CD28的顺磁珠3X28珠接触T细胞，来连接细胞表面蛋白。在一个实施方式中，细胞例如，IO4至IO9个T细胞和珠例如，以1:1比率的DYNABEADS®M-450CD3CD28T顺磁珠在缓冲液优选PBS没有二价阳离子诸如，钙和镁）中进行联组合。此外，本领域技术人员可容易理解可使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可在样本中非常稀少并仅占〇.〇1%的样本，或整个样本即，100%可包括感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的内容内。在某些实施方式中，可期望显著降低其中颗粒和细胞混合在一起的体积（即，增加细胞浓度），以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用大约20亿细胞ml的浓度，在另一个实施方式中，使用多于1亿细胞ml。在进一步的实施方式中，使用细胞浓度10、15、20、25、30、35、40、45或50\106细胞1111。还在另一个实施方式中，使用细胞浓度75、80、85、90、95或100106细胞1111，在进一步的实施方式中，可使用125或150XIO6细胞ml的浓度。利用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩展。进一步地，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，诸如CD28-阴性T细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并将在某些实施方式中期望获得。例如，利用高浓度的细胞允许更有效选择正常具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。[0199]在本发明的一个实施方式中，混合物可被培养数个小时大约3个小时）至大约14天或其间任何个小时的整数值。在另一个实施方式中，混合物可被培养21天。在本发明的一个实施方式中，珠和T细胞在一起培养大约八天。在另一个实施方式中，珠和T细胞在一起培养2-3天。也可期望数个周期的刺激，以便T细胞的培养时间可为60天或更多天。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基（例如，最小必需培养基或RPMl培养基1640或X-vivo15，Lonza，其可包含增殖和存活必须的因子，包括血清例如，胎牛或人血清）、白细胞介素-2IL-2、胰岛素、IFN-γ、几-4、11^-7、61-〇5卩、11^-10、11^-12、11^-15、丁6卩口和丁陬-〇或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉Plasmanate和还原剂诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括1^]\〇1640、八1]\1-¥、01^]\1、]\^]\1、€[-]\^]\^-12、父^¥〇15和父-¥丨¥〇20、优选的Optimizer，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充适当量的血清（或血楽或限定的激素组，和或足够T细胞的生长和扩展量的细胞因子一个或多个）。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅被包括在实验培养物中，而不包括在注入对象的细胞培养物中。靶细胞被保持在支持生长必须的条件下，例如，适当的温度例如，37°C和气氛例如，空气加5%CO2〇[0200]已经暴露于变化刺激时间的T细胞可显示不同的特性。例如，典型的血液或单采的apheresed外周血单核细胞产物具有比细胞毒性或抑制T细胞群TUCD8+更多的辅助T细胞群TH，⑶4+J细胞通过刺激⑶3和⑶28受体的离体扩展在大约8-9天前产生主要由Th细胞组成的T细胞群，而在大约8-9天后，T细胞群包括渐增的更多的T。细胞群。因此，取决于治疗目的，用主要包括Th细胞的T细胞群注入对象可为有利的。类似地，如果已经分离了T。细胞的抗原-特异性亚型，则它可有益于以更大的程度扩展该亚型。[0201]进一步地，除了⑶4和⑶8标记，其他表型标记在细胞扩展过程的进程期间，也显著地但以大部分可重复地变化。因此，这种重复性使针对具体目的调节活化的T细胞产物的能力能够实现。[0202]治疗性应用[0203]本发明包括用慢病毒载体LV转导的细胞例如，T细胞）。例如，LV编码将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3-G、CD28、4-1BB或任何其组合的细胞内结构域联合的CAR。因此，在一些例子中，转导的T细胞可引起CAR-介导的T-细胞应答。[0204]本发明提供了CAR改变初级T细胞对肿瘤抗原的特异性的用途。因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤:施用给哺乳动物表达CAR的T细胞，其中CAR包括特异性地与预定标靶相互作用的结合部分，包括例如人CD3G的细胞内结构域的ζ链部分，和共刺激信号传导区。[0205]在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达CAR，和CART细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CART细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。[0206]在一个实施方式中，本发明的CART细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。在另一个实施方式中，本发明的CART细胞发展成可被重新活化以抑制任何额外肿瘤形式或生长的特异性记忆T细胞。例如，不期望本发明的CART19细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量，并形成特异性记忆T细胞。不希望被任何具体的理论所束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，CART细胞可体内分化成中心记忆样状态。[0207]不希望被任何具体的理论所束缚，由CAR-修饰T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合部分特异性的免疫应答。例如，CART19细胞引起抗表达CD19的细胞的特异性免疫应答。[0208]尽管本文公开的数据具体公开了包括源于FMC63鼠科单克隆抗体的抗-CD19scFV、人CDSa铰合和跨膜结构域、和人4-1BB和CD3G信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化，如本文其他地方所述的。即，本发明包括CAR中任何抗原结合部分产生对抗原结合部分特异性的CAR-介导的T-细胞应答的用途。例如，本发明的CAR中的抗原结合部分可出于治疗癌症的目的靶向肿瘤抗原。[0209]可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤癌症和儿童肿瘤癌症。[0210]血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学（或血原性癌症的例子包括白血病，包括急性白血病诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病）、慢性白血病诸如慢性髓细胞粒细胞性）白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病）、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤无痛和高等级形式）、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。[0211]实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名诸如肉瘤、癌和淋巴瘤）。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒膜癌、维尔姆斯氏肿瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤诸如神经胶质瘤诸如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤）、成胶质细胞瘤池已知为多形性成胶质细胞瘤星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移）。[0212]在一个实施方式中，本发明的CAR的抗原结合部分被设计以治疗具体的癌症。例如，被设计以靶向CD19的CAR可用于治疗癌症和紊乱，包括但不限于前-BALL儿童指征）、成人ALL、套细胞淋巴瘤、扩散大B-细胞淋巴瘤，同种骨髓移植后的补救等等。[0213]在另一个实施方式中，CAR可被设计以靶向⑶22,治疗扩散大B-细胞淋巴瘤。[0214]在一个实施方式中，癌症和紊乱包括但不限于前-BALL儿童指征），成人ALL、套细胞淋巴瘤、扩散大B-细胞淋巴瘤、同种骨髓移植后的补救等等，其可利用靶向CD19、CD20、⑶22和RORl的CAR的组合进行治疗。[0215]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向间皮素，来治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等等。[0216]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向⑶33IL3Ra，来治疗急性骨髓性白血病等等。[0217]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向c-Met，来治疗三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌等等。[0218]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向PSMA，来治疗前列腺癌等等。[0219]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向糖脂F77,来治疗前列腺癌等等。[0220]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向EGFRvIII，来治疗成胶质细胞瘤等等。[0221]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向⑶-2,来治疗神经细胞瘤、黑素瘤等等。[0222]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向NY-ESO-1TCR，来治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。[0223]在一个实施方式中，CAR可被设计以靶向MGEA3TCR，来治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。[0224]然而，本发明不应被解释为仅限于本文公开的抗原标靶和疾病。相反地，本发明应被解释为包括任何与可使用CAR治疗的疾病相关的抗原标靶。[0225]本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。[0226]对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i扩展细胞，ii将编码CAR的核酸引入细胞，和或iii冷冻保存细胞。[0227]离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物优选人）中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰（S卩，体外转导或转染）XAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的（syngeneic或异种的。[0228]在此通过引用并入的在美国专利号5,199,942中描述的造血干细胞和祖细胞的离体扩展程序，可被应用至本发明的细胞。其他合适的方法在本领域中是已知的，因此本发明不限于细胞离体扩展的任何具体方法。简单地说，T细胞的离体培养和扩展包括：（1从外周血收获物或骨髓外植体收集来自哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞;和2离体扩展这样的细胞。除了美国专利号5，199,942中描述的细胞生长因子，其他因子诸如^七3-1^、11^-1、IL-3和c-kit配体，也可用于培养和扩展细胞。[0229]除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。[0230]通常地，如本文所述活化和扩展的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。特别地，本发明的CAR-修饰的T细胞用于治疗CCL。在某些实施方式中，本发明的细胞用于治疗处于形成CCL风险中的患者。因此，本发明提供了治疗或预防CCL的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。[0231]本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和或与其他组分诸如IL-2或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等;碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇;蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸;抗氧化剂;螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽;佐剂例如，氢氧化铝）；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。[0232]本发明的药物组合物可以以适于待治疗或预防）的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度一一尽管适当的剂量可由临床试验确定。[0233]当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者（对象）的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以IO4至IO9个细胞kg体重的剂量，优选IO5至IO6个细胞kg体重的剂量——包括那些范围内的所有整数值一一施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术见例如Rosenberg等，NewEng.J.ofMed.319:1676,1988施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。[0234]在某些实施方式中，可期望向对象施用活化的T细胞，并随后重新抽取redraw血液或实施单采血液成分术），根据本发明活化来自其中的T细胞，和用这些活化和扩展的T细胞再注入该患者。该过程可每几个周进行多次。在某些实施方式中，T细胞可从IOcc至400cc的血液抽取中进行活化。在一些实施方式中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、7〇CC、8〇CC、9〇CC或IOOcc的血液抽取中进行活化。不被理论所束缚，利用多份血液抽取多个再输注方案可用于选出某些T细胞群。[0235]对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内（i.v.注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。[0236]在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合例如，之前、同时或之后）施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗:所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷也已知为ARA-C或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用:化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫烧蚀剂诸如CAMPATH、抗-CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇类、FR901228、细胞因子和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶一一钙调磷酸酶环孢菌素和FK506或抑制对生长因子诱导的信号传导（雷帕霉素）重要的p70S6激酶Liu等，Cell66:807-815，1991;Henderson等，Immun·73:316-321，1991;Bierer等，Curr·Opin，Tmmun.5:763-773，1993。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法XRT、环磷酰胺或抗体诸如0KT3或CAMPATH的T细胞烧蚀疗法结合例如，之前、同时或之后）而施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的细胞组合物在B-细胞烧蚀疗法诸如与CD20反应的试剂例如Rituxan后进行施用。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。[0237]施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。例如，CAMPATH的剂量对于成人患者将通常在1至大约IOOmg的范围中，通常每天施用，持续1和30天之间的时期。尽管在一些例子中可使用上至40mg每天的较大剂量美国专利号6，120，766中描述），但优选的日剂量为1至IOmg每天。[0238]实验实施例[0239]本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。[0240]没有进一步的描述，相信利用先前的描述和以下的说明性实施例，本领域技术人员可制造和利用本发明的化合物，并实践请求保护的方法。以下工作实施例因此具体指出本发明的优选实施方式，并不解释为以任何方式限制本公开背景的剩余部分。[0241]实施例1:表达嵌合受体的T细胞在具有晚期白血病的患者中建立记忆和有效的抗肿瘤效应[0242]被工程改造以表达嵌合抗原受体CAI?的淋巴细胞在先前临床试验中已经证明了最小的体内扩展和抗肿瘤效应。本文显示的结果证明在注入治疗的具有晚期慢性淋巴细胞白血病CLL的三个患者中的三个后，包含⑶137的CART细胞具有有效的非交叉抗性临床活性。被工程改造的T细胞体内扩展超过一千倍，运送至骨髓并继续以高水平表达功能性CAR至少6个月。平均起来，每个注入的CAR+T细胞根除至少1000个CLL细胞。在血液和骨髓中证明CD19特异性免疫应答，伴随三个患者中的两个完全缓和。一部分细胞持续作为记忆CAR+T细胞，指示该非MHC限制性方法有效治疗B细胞恶性肿瘤的潜力。[0243]现在描述在这些实验中使用的材料和方法。[0244]材料和方法[0245]一般的实验室说明[0246]研究样本处理、冷冻和实验室分析在宾夕法尼亚大学的翻译和相关研究实验室TranslationalandCorrelativeStudiesLaboratory中进行，该实验室在良好实验室实践GoodLaboratoryPractice的原则下以建立的用于样本接收、处理、冷冻和分析的SOP和或协议运行。测定性能和数据报告符合MIATA指南Janetzki等，2009,Immunity31:527-528〇[0247]方案设计[0248]临床试验NCT01029366如在图1中图解地进行。具有⑶19阳性血液恶性肿瘤的如此患者适合该试验，所述患者在至少两个之前的治疗方案后具有持续的疾病，并且不适合同种异基因的干细胞移植。在肿瘤再分级restaging后，用于CART19制造的外周血T细胞通过单采血液成分术收集，并且在注入前的一周期间提供给对象单一过程的化疗，如图10所规定的。CART19细胞以图10中指示的剂量，使用3天分次剂量方案（10%、30%和60%通过静脉内注入施用，并且如果可行，在第10天施用第二剂量;仅患者UPN02具有足够的细胞用于第二次注入。以频繁的间隔评估对象的毒性和应答，持续至少6个月。该方案由美国食品药品管理局（USFoodandDrugAdministration、重组DNA咨询委员会AdvisoryCommittee和宾夕法尼亚大学的机构审查委员会InstitutionalReviewBoard批准。注入的第一天设定为研究第〇天。[0249]对象:临床总结[0250]临床总结在图10中概述，并且详细的历史在本文的其他位置提供。患者UPNO1在55岁时首次诊断为第Π阶段B细胞CLL。该患者无临床症状并被观察大约1-12年，直到需要对进行性淋巴细胞增多、血小板减少、腺病和脾肿大治疗。在该时间过程内，该患者接受当前的疗法priorlinesoftherapy。最近的疗法为在CART19细胞注入前2个月的2个周期的喷司他丁、环磷酰胺和利妥昔单抗，伴随最小应答。该患者随后接受一个周期的苯达莫司汀作为在CART-19细胞注入前的淋巴耗尽化疗。[0251]患者UPN02在68岁，当该患者显示疲劳和白细胞增多时，首次诊断患有CLL。该患者相对稳定持续4年，此时该患者形成需要治疗的进行性白细胞增多（195,000μ1、贫血症和血小板减少。核型分析显示CLL细胞已经缺失染色体17ρ。因为进行性疾病，该患者用阿仑单抗治疗，有部分缓解，但在一年半内，该患者具有进行性疾病。该患者用阿仑单抗再治疗18个周，有部分缓解，并且1年无进展的间隔时间。该患者随后接受2个周期的苯达莫司汀和利妥昔单抗，没有显著应答（图5Α。该患者在CART-19细胞注入前，接受单一试剂苯达莫司汀作为淋巴耗尽化疗。[0252]患者UPN03在50岁显示无症状第I阶段CLL，并随后观察数年。该患者具有需要治疗的进行性白细胞增多（白细胞计数92,000μ1和进行性腺病。该患者接受2个周期的利妥昔单抗和氟达拉滨，其导致血细胞计数正常化和显著的改善，尽管没有完全解决腺病。该患者具有大约3年的无进展的间隔时间。核型测试显示细胞包含染色体17ρ的缺失，FISH证明200个细胞中的170个中ΤΡ53缺失。在接下来的数年中，该患者需要针对进行性白细胞增多和腺病的3种不同线的疗法图10，最后在CARTl细胞注入前接受阿仑单抗6个月，有部分缓解。在CART-19细胞注入前，该患者接受喷司他丁和环磷酰胺作为淋巴耗尽化疗。[0253]载体产生[0254]CD19-BB-Z转基因（GeMCRIS0607-793如所述进行设计和构造Milone等，2009，MolTher.17:1453-1464。慢病毒载体如所述根据目前良好的制造实践，利用Lentigen公司的三质粒生产方法进行生产（Zufferey等，1997，Naturebiotechnoll5:871_875。[0255]CART19细胞产物的制备[0256]已经描述了利用包被有抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体的顺磁聚苯乙烯珠的T细胞制备方法Laport等，2003，Blood102:2004-2013。慢病毒转导如所述进行（Levine等，2006，ProcNatlAcadSciUSA103:17372-17377。[0257]肿瘤负荷计算的方法[0258]估计基线上的CLL负荷，如图10所示。如下述计算骨髓、血液和次级淋巴组织中的CLL细胞数量。[0259]骨髓：在健康的成人中，骨髓占大约5%的总体重（Woodard等，1960，PhysMedBiol，5:57-59;Bigle等，1976，HealthPhys31:213-218。髂嵴样本中的骨髓具有随年龄增加的非活性脂肪骨髓百分比，从5岁的总骨髓的20%上升至35岁的大约50%，此时它保持稳定，直到65岁，并且随后到75岁上升至大约67%的非活性骨髓Hartsock等，1965，AmJClinPath43:326-331。35岁男性的活性红细胞和非活性脂肪骨髓的总骨骼重量的国际参考值目前分别设定为1170g和2480gBasicanatomicalandphysiologicaldataforuseinradiologicalprotection:TheSkeletoninAnnalsoftheICRP用于放射防护的基础解剖和生理学数据：ICRP年报中的骨骼），Vol.25ed.Smith，H.58-68放射防护国际委员会的委员会2的任务组的报告，牛津，1995。35岁至65岁之间的成年男性具有占总体重5.0%、由1.6%的活性红细胞骨髓和3.4%的非活性脂肪骨髓组成的骨髓（Basicanatomicalandphysiologicaldataforuseinradiologicalprotection:TheSkeletoninAnnalsoftheICRP，Vol.25ed.Smith，H.58-68放射防护国际委员会的委员会2的任务组的报告，牛津，1995。基于骨髓活组织检查和吸取物标本，计算基线上三个患者的CLL细胞的重量，如表1所示。这些总CLL骨髓质量的估计值随后利用IKg=IO12个细胞转变成骨髓中的总CLL细胞数，并且所得数目显示在图10中。这些计算基于CLL在骨髓中具有均匀分布的假设。对于患者UPN01，显示对在苯达莫司汀化疗前获得的骨髓活组织检查，和在苯达莫司汀之后且CART19注入前获得的吸取物的计算。由于第-1天吸取物的技术限制，与第-14天活组织检查标本相比，第-1天吸取物的数目不太精确。患者UPN02具有单一治疗前活组织检查标本，其显示骨髓由CLL完全取代。该患者在CART19后的第30天具有未改变的标本。患者UPN03的骨髓负荷基于化疗后且CART19活组织检查前进行计算。[0260]表1:骨髓质量[0261][0262][0263]血液:仅患者UPN02在CART19注入前的血液中具有大量CLL肿瘤负荷。流式细胞术显示该细胞具有典型的表型作为具有弱dim表面κ限制的⑶5+⑶10-CD19+⑶20弱+CD23可变的）+IgM-B细胞群的克隆群。大约35%的CLL细胞共表达的⑶38XLL负荷没有通过3个周期的苯达莫司汀化疗清除，并且在CART19注入时存在。在CART19注入时，血液中的CLL计数为55，000个细胞AiL。假设血液体积为5.OL，患者UPN02在第0天在血液中具有2.75XIO11个CLL细胞。在患者UPN01和03中给出正常的全部WBC，没有计算这些患者中的循环疾病负荷，其将导致略微低估总身体负荷。[0264]次级淋巴组织:淋巴腺病和脾肿大的体积利用FDA-批准软件在轴向CT扫描上进行定量。该体积仅针对胸部、腹部和骨盆。在所有患者中测量从Tl椎体至股总动脉分叉的水平面的质量，和在一些患者中，也包括腹股沟区中的结node。头颈中的结和骨端被排除不进行分析并从基线CLL靶细胞数中排除，其也将导致略微低估总身体负荷。患者UPN01和03已经具有持续的完全缓和超过6个月，并且因此公式基线体积-第3月体积）用于确定肿瘤负荷从基线的减小；患者UPN02具有腺病中的稳定疾病，并且因此基线肿瘤质量通过从年龄匹配的健康男性减去参考脾体积进行估计（Harris等，2010，EurJRadiol75:e97-6101。基线肿瘤质量利用密度方法（1敁1密度，和1此=1012个细胞或体积方法0^细胞为1〇μM直径或600fL，假设为球形转变为CLL细胞，并且两个值显示在图10中。三个患者中次级淋巴组织中的肿瘤体积在以下显示在表2中，如从可用的CT扫描计算的。表2:肿瘤体积[0265][0266]患者UPN01的基线CT扫描在2个周期的喷司他丁环磷酰胺利妥昔单抗后8天实施，并显示与先前的CT扫描相比，对该化疗方案无应答。该患者在CART19前具有一个周期的苯达莫司汀，并且因此，对于UPN01从第-37天至第+31天的肿瘤体积的改变不可排除苯达莫司汀以及CART19的潜在贡献。类似地，UPN03的肿瘤体积的改变反映了1个周期的喷司他丁环磷酰胺和CART19的联合效应。[0267]估计患者中有效体内E:T比率的方法[0268]注入的CART细胞与杀死的肿瘤细胞数的E:T比率利用在CART细胞注射时存在的肿瘤细胞数和注射的CART细胞数进行计算Carpenito等，2009，ProcNatlAcadSciUSA106:3360-3365。对于本发明，使用如图10所示的注射的CART19+T细胞数，因为不可能以足够的准确性或精确性确定体内存在的CART19+T细胞的绝对数。如图2和图6所描绘的，血液和骨髓中CART19扩展的可用数据是稳固的。然而，不可能确定CART19向其他位置诸如次级淋巴组织的运输，产生在最大肿瘤减小时体内获得的CART19细胞总数的大量不确定性。表3的计算值用于得到有效的E:T比率。[0269]表3:计算的体内获得的CART19E:T比率[0271]1=密度和体积方法的平均[0272]2=患者UPN02在骨髓中不应答，并且具有由脾和淋巴结中的CT测量的腺病3.IE+11个细胞中肿瘤质量的部分减小。对在血液中应答，参见图5A。[0273]样本处理和冷冻[0274]样本外周血、骨髓在淡紫色顶部K2EDTA或红色顶部无添加剂vacutainer管BectonDickinson中收集，并在抽取的2个小时内传递至TCSL。样本根据建立的实验室S0P，在接收的30分钟内进行处理。外周血和骨髓单核细胞利用Ficoll-PaqueGEHealthcare，17-1440-03经Ficoll密度梯度离心法进行纯化，并利用5100Cryo1°冷冻容器在补充有4%人血清白蛋白（GeminiBio-Products，800-120、2%HetastarchNovaplus，NDC0409-7248-49和10%DMS0Sigma，D2650的RPMlGibco11875-135中进行冷冻；在-80°C下24-72小时后，将细胞转移至液氮以便长期保存。单采血液成分术样本通过宾夕法尼亚大学医院血库获得并在CVPF中通过Ficoll梯度纯化进行处理，和如上进行冷冻。当评估时，解冻后即刻的存活大于85%。对于血清分离，允许样本在室温下凝固1.5-2个小时;血清由离心法进行分离，和单一使用1〇〇μ1等分试样在-80°C下冷冻。[0275]细胞系[0276]K562CML，CD19-阴性）从ATCCCCL-243获得。K562CD19—CarmineCarpenito的慷慨礼物，并且为以100%频率进行慢病毒转导以表达⑶19分子的K562JALM-6是⑶19-阳性非T、非BALL前体B细胞系（Hurwitz等，1979,IntJCancer23:174-180并证实表达⑶19抗原，是LaurenceCooper的慷慨礼物。将以上细胞系保持在补充有10%胎牛血清Hycione和l%Pen-StrepGibco,15140-122的RlO培养基（RPMI1640Gibco,11875中。来自健康捐赠者的外周单核细胞ND365由来自宾夕法尼亚大学的人免疫学核心的单采血液成分术获得，如上被处理并冷冻。[0277]DNA分离和Q-PCR分析[0278]全血或骨髓样本在淡紫色顶部K3EDTABDvacutainer管（BectonDickinson中收集。基因组DNA利用QIAampDNA血液中量提取试剂盒Qiagen和建立的实验室SOP直接从全血中分离，由分光光度计定量，并在-80°C下进行保存。对基因组DNA样本的Q-PCR分析利用123-200ng基因组DNA时间点、ABITaqman技术和确认的检测整合的⑶19CAR转基因序列的测定成批实施。从资格研究和预建立的认可范围，计算通过失败参数范围，包括标准曲线斜率和r2值，准确定量参考样本（1000个拷贝质粒掺杂spike的能力和健康的捐赠者〇嫩样本中的无扩增。00190六畴专基因的引物探针如所述的1^1〇116等，2009，]\1〇11116117:1453-1464。为了确定拷贝数单位DNA，产生8点标准曲线，其由被掺杂入IOOng非转导的对照基因组DNA的106-5拷贝慢病毒质粒组成。每个数据点样本、标准曲线、参考样本一式三份进行评估，报告平均值。对于患者UPN01，所有的报告值都源于33复制中的阳性Ct值，％CV小于0.46%。对于患者UPN02，除了第+177天样本23复制阳性，高％CV，所有的报告值都源于33复制中的阳性Ct值，％CV小于0.72%。对于患者UPN03，除了第+1天样本23复制阳性，0.8%CV和第+3天样本23复制阳性，0.67%CV，所有的报告值都源33复制中的阳性Ct值，％CV小于1.56%。测定的定量下限LLOQ由标准曲线确定为2拷贝微克DNA10个拷贝200ng输入DNA;考虑LLOQ以下的平均值（即可报告但不可计量的）为近似的。控制询问的DNAinterrogatedDNA的量的平行扩增反应利用以下实施：12-20ng输入基因组DNA，对⑶KNIA基因（GENEBANK:Z85996上游的非转录基因组序列特异性的引物探针组合有义弓丨物：GAAAGCTGACTGCCCCTATTTG;SEQIDN0.25,反义弓丨物：GAGAGGAAGTGCTGGGAACAAT;SEQIDNO.26,探针：VIC-CTCCCCAGTCTCTTT;SEQIDNO.27，和由稀释对照基因组DNA产生的8点标准曲线;这些扩增反应产生校正系数CFng检测的Ag输入的）。拷贝转基因微克DNA根据下述公式进行计算：由CD19标准曲线计算的拷贝输入DNAngXCFX1000ng。该测定的准确度根据下述公式通过Q-PCR量化注入细胞产物的标记的能力确定：平均标记=检测的拷贝输入的DNAX6.3pgDNA男性体细胞XCF，与利用CAR-特异性检测反应物，通过流式细胞术的转基因阳性率positiVity相比较。这些盲确定（blindeddetermination对UPN01注入产物产生了22.68%的标记（22.6%，通过流式细胞术），对UPN02注入产物产生了32.33%的标记23%，通过流式细胞术），和对UPN03注入产物产生了4.3%的标记4.7%标记，通过流式细胞术）。[0279]细胞因子分析[0280]可溶性细胞因子的量化利用从LifetechnologiesInvitrogen购买的Luminex珠阵列技术和试剂盒实施。按照制造商协议，利用3倍系列稀释产生的8点标准曲线实施测定。每个标准点和样本以1:3稀释一式两份进行评价;对于两份测量，计算的％^小于15%。数据利用5参数逻辑回归分析，在Bioplex200上获得并用BioplexManager5.0版软件分析。标准曲线量化范围由80-120%观察期望值范围确定。个体分析物量化范围在图说明中报告。[0281]检测CAR功能的细胞测定[0282]细胞在TCM中解冻和静置过夜后，通过测量响应靶细胞的CD107脱粒，来评价功能性。脱粒测定利用在48孔平板中最终体积500μ1的1\10叩81^和0.25\106靶细胞，在371€下、在CD49dBectonDickinson、抗-CD28、莫能星（e-Bioscience和CD107a_FITC抗体eBiosciences存在下，基本如所述的，进行2个小时Betts等，2003,JTmmunolMethods281:6578。[0283]抗体反应物[0284]这些研究使用以下抗体:MDA-CAR——缀合至Alexa647的鼠科抗CD19CAR抗体，是BipulenduJena和LaurenceCooper博士（MDAndersonCancerCenter的慷慨礼物。对于多参数免疫表型分析和功能测定:抗-CD3-A700、抗-CD8-PE-Cy7、抗-PD-1-FITC、抗-CD25-AF488、抗-CD28-PercP-Cy5·5、抗-CD57-eF450、抗-CD27-APC-eF780、抗-CD17-APC-eF780、抗-CD45RA-eF605NC、CD107a-FITC都来自e-Bioscience、抗-CD4-PE-TexasRed和LiveDeadAqua来自LifeTechnologies和抗-CD14-V500、抗-CDl6-V500来自BectonDickinson。对于通常的免疫表型分析：CD3-PE、CD14-APC、CD14-PE-Cy7、CD16-FITC、CD16PE-Cy7、CD19-PE-Cy7、CD20-PE，所有都来自BectonDickinsono[0285]多参数流式细胞术[0286]细胞通过流式细胞术进行评价，如果是新鲜的，在FicolI-Paque处理后，或者如果是冷冻的，在静置过夜后，以密度2XIO6个细胞ml的密度在补充有5%人AB血清GemCall，100-512、I%HepesGibco，15630-080、I%Pen-StrepGibco，15140-122、I%GlutamaxGibco，35050-061和0·2%N-乙酰基半胱氨酸AmericanRegent，NDC0517-7610-03的T细胞培养基TCMX-vivo15Lonza，04-418Q中进行。多参数免疫表型分析利用如正文所述的FMO染色，对4XIO6个总细胞条件进行。细胞利用由制造商推荐的抗体和反应物浓度，在冰上，在IXIO6个细胞Λ〇〇μ1PBS的密度下染色30分钟，冲洗，重悬浮在0.5%低聚甲醛中，并利用用于以上抗体组合的检测和分离的装备有蓝色（488nm、紫色（405nm、绿色532和红色（633nm激光器和适当滤光器组的修改的LSRIIBDImmunocytometry系统）获得。每个染色获得最小100，〇〇〇个CD3+细胞。为了功能测定，细胞被冲洗、对表面标记染色、重悬浮在0.5%低聚甲醛中并如上获得；对每个染色条件收集最小50，000个CD3+事件event。补偿值利用单一抗体染色和BD补偿珠BectonDickinson确定，并由仪器计算和自动应用。利用Flowjo软件8.8.4版，Treestar分析数据。对于通常的免疫表型分析，细胞利用装备有蓝色488和红色633nm激光器的AccuriC6细胞计数器获得。补偿值利用单一抗体染色和BD补偿珠（BectonDickinson确定，并手动计算。利用C-Flow软件分析包1.0,264.9版，Accuri细胞计数器分析数据。[0287]患者过去的病史和对疗法的应答[0288]临床治疗总结在图10中概述。患者UPN01在55岁时首次诊断为第II阶段B细胞CLL。该患者无临床症状并被观察大约1-12年，直到需要对进行性淋巴细胞增多、血小板减少、腺病和脾肿大治疗。在4个周期的氟达拉滨后，该患者具有完全正常的血细胞计数和CT扫描的完全缓解。在5个月内记录到进展，具有无临床症状的淋巴细胞增多、血小板减少和增加的腺病。该患者被观察到没有症状持续大约3年，和后来需要用利妥昔单抗和氟达拉滨治疗进行性白细胞增多、贫血症和血小板减少。该患者用4个周期的利妥昔单抗和氟达拉滨进行治疗，血细胞计数部分改善。该患者再次在一年内有所进展，需要由白细胞增多WBC150,000μ1和血小板减少血小板30,000μ1清楚表示的疗法，并用阿仑单抗进行治疗，血细胞计数正常。在13个月内记录到进展。该患者随后接受单一试剂利妥昔单抗，没有显著应答，并且随后是利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松R-CVP，持续2个周期，具有最小应答，随后使用来那度胺。因为毒性，来那度胺停药。该患者接受2个周期的喷司他丁、环磷酰胺和利妥昔单抗，具有最小应答。[0289]后来，患者在CART19细胞注入前4天接受苯达莫司汀作为淋巴耗尽化疗。在治疗前，WBC为14，200μ1，血红素11·4gmdl，血小板计数78，000μ1和ALC为8000μ1XT扫描显示扩散的腺病，和骨髓大量被CLL67%的细胞浸润。患者接受了1.6XIO7个CART-19细胞kg1.13XIO9个总CART19细胞，如通过FACS评估的）。无注入毒性。该患者在苯达莫司汀后大约10天和在CART19细胞注入后6天成为中性白细胞减少，并在首次CART19注入后10天开始，该患者患发热、寒战和短暂的低血压。同时，胸部X-射线和CT扫描证明用抗生素治疗的左上叶肺炎。发热持续大约2个周，并当嗜中性白细胞恢复时其得以解决。该患者已经不具有进一步的感染或全身症状。[0290]该患者实现了如图5中所描绘的快速和完全缓解。在注入后1到6个月之间，在血液中通过流式细胞术没有检测到循环的CLL细胞。在CART-19细胞注入后1、3和6个月的骨髓通过形态学和流式细胞术测试显示了持续不存在淋巴细胞浸润。在注入后1和3个月的CT扫描显示了异常腺病的完全解决。该患者已经具有持续的白细胞减少WBC1000-3900ul和血小板减少血小板，大约l〇〇,〇〇〇ul，和轻度低丙种球蛋白血症（IgG525mgdL，正常650-2000mgdL，但没有感染并发症。[0291]患者UPN02在77岁用CART19细胞进行治疗。该患者具有相关的冠状动脉疾病史，并且在2000年68岁，当该患者出现疲劳和白细胞增多时，被首先诊断患有CLL。该患者相对稳定持续4年，此时该患者形成需要治疗的进行性白细胞增多（195,000μ1、贫血症和血小板减少。那时的遗传测试显示CLL细胞具有染色体17ρ的缺失。因为进行性疾病，该患者用12周疗程的阿仑单抗治疗，有部分缓解并且血细胞计数改善。在1年半内，该患者具有进行性白细胞增多、贫血症、血小板减少和脾肿大。核型分析证实染色体17ρ的缺失，现在具有染色体13q的缺失。该患者再次用阿仑单抗治疗18周，具有白细胞增多的改善和贫血症和脾肿大的稳定。该患者一年内具有进行性白细胞增多、贫血症和血小板减少的迹象。治疗包括2个周期的苯达莫司汀和利妥昔单抗，导致病情稳定，但没有如图5A所示的显著改善。[0292]该患者在CART-19细胞注入前仅接受苯达莫司汀作为淋巴耗尽化疗，以3个分次注入，该患者接受4.3XIO6个CART19细胞kg4.1XIO8个总细胞），该患者并发高至102度的短暂发热，持续24个小时。在首次注入后的第11天，该患者接受4.1XIO84.3X106kg个CART19细胞的增强，并且该注入并发需要24个小时住院治疗的发热、寒战和呼吸急促但无缺氧。没有心肌缺血的证据，并且症状被解决。在首次CART-19注入后的第15天，和在增强CARTl9细胞注入后的第4天，该患者因高热（高至104°F、冷颤和寒战被许可住院。利用血液和尿培养物以及CXR的大量测试不能鉴定感染源。该患者抱怨呼吸急促但没有缺氧。超声心动图显示了严重的运动功能减退。射血分数为20%。该患者接受泼尼松Img每千克持续一天和0.3mg每千克持续大约一周。这导致发热和心功能不全快速解决。[0293]与开始高热同时，该患者具有来自外周血的淋巴细胞的快速下降，如图5A所描绘的。尽管该患者具有正常化的白细胞计数，但该患者具有持久的循环CLL、稳定的中度贫血症和血小板减少。骨髓在治疗后一个月显示持久的大量的CLL浸润，尽管有显著的外周血细胞减少，和CT扫描显示腺病和脾肿大的部分减小。在CART19细胞注入后五个月，该患者形成进行性淋巴细胞增多。在注入后九个月，该患者具有淋巴细胞增多（16,500μ1和稳定的适度的贫血症和血小板减少，腺病稳定。该患者保持无临床症状并还没有进一步的疗法。[0294]患者UPN03在50岁被诊断为无临床症状的第I阶段CLL，并且随后观察6年。后来，该患者具有需要治疗的进行性白细胞增多（白细胞计数92,000μ1和进行性腺病。该患者接受2个周期的利妥昔单抗和氟达拉滨，导致血细胞计数的正常化和显著改善，尽管没有完全解决腺病。该患者具有大约3年的无进展的间隔时间，随后在接下来6个月内是需要治疗的快速进行性白细胞增多WBC165,000μ1和进行性腺病。该患者接受一个周期的氟达拉滨和3个周期的利妥昔单抗和氟达拉滨，具有正常化的血细胞计数并解决明显palpable的腺病。该患者具有大约20个月无进展的间隔时间，直到该患者再次快速形成进展性白细胞增多和腺病。在这时，骨髓被CLL大量浸润，并且核型分析显示细胞包含染色体17p的缺失，在170200细胞中FISH证明TP53缺失。该患者接受一个周期的利妥昔单抗和苯达莫司汀，随后是4个周期的仅苯达莫司汀（由于对利妥昔单抗的严重变应性反应）。该患者具有最初正常化的血细胞计数，但在疗法中止之后不久具有进行性白细胞增多和腺病。[0295]从患者UPN3用单采血液成分术收集自体T细胞并冷藏。该患者随后用阿仑单抗治疗11周，具有优异的血液学应答。腺病尽管没有完全解决但有改善。在接下来的6个月内，该患者病情活跃但稳定。后来，在CART19细胞注入前，该患者接受喷司他丁和环磷酰胺作为淋巴耗尽化疗。[0296]在化疗后三天但在细胞注入前，骨髓是细胞过多的（60%，大约40%牵涉CLL。因为如表3和Bonyhadi等，2005，JImmunol174:2366-2375所述的，从CLL患者单采血液成分术收集固有的制造限制，该患者在3天中被注入总共1.46XIO5个CART19+细胞每kg1.42XIO7个总CART19+细胞）。没有注入毒性。在首次注入后十四天，该患者开始具有为治疗症状的冷颤、高至l〇2°F的发热、寒战、恶心和腹泻。该患者没有呼吸或心脏症状。到注入后的第22天，肿瘤溶解综合征通过由升高的LDH、尿酸清楚表示而诊断，并发有肾功能不全。该患者被送院并用流体复苏和拉布立酶治疗，尿酸和肾功能快速正常化。利用CXR、血液、尿和粪便培养物进行详细的临床评价，并且全部是阴性或正常的。[0297]在1个月的CART-19注入内，通过形态学、流式细胞术、细胞遗传学和FISH分析，该患者从血液和骨髓中清除循环CIX，并且CT扫描显示解决了异常腺病（图5C。该患者的缓和从最初的CART19细胞注入起已经持续超过8个月。[0298]现在描述实验结果。[0299]临床方案[0300]具有晚期、耐化疗CLL的三位患者被招收至试验性临床试验，如图1所描绘的。所有的患者都用多种化疗和生物学方案广泛地进行预治疗，如图10所示。患者中的两位具有P53缺陷CLL——一种预示对常规疗法弱应答并快速进展的缺失（Dohner等，1995,Blood，851580-1589。患者中的每一个在准备性化疗之后都具有大的肿瘤负荷，包括大量骨髓浸润40至95%和淋巴腺病；患者UPN02也具有显著的外周淋巴细胞增多。CART19T细胞如图IB所描绘地制备，并且每个患者的细胞制造和产物特征的细节显示在表4中。所有患者在CART19T细胞注入前用淋巴耗尽化疗预治疗1-4天。因为试验测试并入4-1BB共刺激信号传导区的CAR，所以使用分次剂量细胞注入安排，如图IA所绘的。[0301]表4:单采血液成分术产物和CART19产物释放标准[0302][0304]1=剂量#2。[0305]2=第12天的测定值在LOQ以下，并从扩展初期一直降低，与自载体产生的质粒DNA的遗留一致。作为信息修改提交给FDA。[0306]3=基于FACS的表面染色的产物释放。[0307]4=针对外部DSMC和IRB的释放标准准许的治疗例外。[0308]CART19的体内扩展和持久性，以及运送至骨髓[0309]相信利用⑶3⑶28珠扩展的并表达4-1BB信号传导结构域的CAR+T细胞对缺少4-IBB的CAR是有改善的。开发Q-PCR测定，以便能够定量跟踪血液和骨髓中的CART19细胞。所有患者在血液中都具有CART19-细胞的扩展和持久性，持续至少6个月，如图2A和2C所绘的。特别地，患者UPN01和UPN03在注入后第一个月期间在血液中具有1，000至10,000倍扩展的CAR+T细胞。峰值扩展水平与患者UPN01第15天和患者UPN03第23天）的注入后临床症状的开始同时。此外，在可用一阶动力学模拟的最初延迟在后，CART19T细胞水平在注入后，从天90至180,在所有3位患者中稳定。显著地，CART19T细胞也被运送至所有患者的骨髓，尽管低于血液中观察的水平5至10倍，如图2D至2F所描绘的。患者UPN01和03在骨髓中具有对数线性延迟，消失T1A为大约35天。[0310]CART19注入后血液和骨髓区室中特异性免疫应答的诱导[0311]来自所有患者的血清样本被收集并成批分析，以定量确定细胞因子水平，评估一组细胞因子、趋化因子和其他可溶因子，以评估潜在毒性并提供CART19细胞功能的证据，如图3所描绘的。在三十种测试的分析物中，十一种具有从基线3倍或更多的改变，包括4种细胞因子（IL-6、INF_γ、IL_8和IL-10，5种趋化因子（MIF-la、MIF-1P、MCP_1、CXCL9、CXCL10和IL-IRa和IL_2Ra的可溶受体。这些中，干扰素-γ具有从基线最大的相对改变。有趣地，UPN01和UPN03中细胞因子升高的峰值时间与先前描述的每个患者的临床症状和血液中CART19细胞的峰值水平时间地（temporally相关。仅记录到患者UPN02中的适度改变，有可能是由于提供给该患者的皮质类固醇治疗的结果。可溶IL-2的升高没有在该患者的血清中检测到，即使用4-1BB信号传导结构域的形成CAR+T细胞的临床前基本原理之一是与CD28信号传导结构域相比降低的触发IL-2分泌的倾向（Milone等，2009，M〇1Ther.17:1453-1464。这可与持续的临床活性有关，因为先前的研究已经显示CAR+T细胞有可能被调节T细胞抑制Lee等，2011,CancerRes71:2871-2881，细胞可通过分泌大量IL-2的CAR或通过注入后提供外源IL-2而引起。最终，如图3D所描绘的，观察到在来自UPN03的骨髓吸取物的上清液中细胞因子分泌的稳固诱导，其也与肿瘤溶解综合征的发展和完全缓和同时。[0312]血液中记忆CART19细胞群的延长表达和建立[0313]CAR-介导的癌症免疫疗法的中心问题是最化的细胞制造和共刺激结构域是否提高了基因修饰T细胞的持久性并且允许在患者中建立CAR+记忆T细胞。先前的研究还没有证明注入后T细胞上CAR的稳固扩展、延长的持久性和或表达Kershaw等，2006，ClinCancerRes12:6106-6115;Lamers等，2006，JClin0ncol24:e20-e22;Till等，2008，Blood，112，2261-2271;Savoldo等，2011，JClinInvestdoi:10.1172JCI46110。注入后第169天，来自血液和骨髓两者的样本的流式细胞检测分析显示在UPN03中存在CAR19表达细胞（图4A和4B，和不存在B细胞，如图4A所描绘的。值得注意地，通过Q-PCR测定，所有三个患者在4个月和更长都具有持久性的CAR+细胞，如图2和图6所描绘的。流式细胞术的CAR+细胞的体内频率密切匹配从对CART19转基因的PCR测定获得的值。重要地，在患者UPN03中，仅⑶3+细胞表达CAR19,因为CAR19+细胞在⑶16或⑶14-阳性亚型中是不可检测的，如图4A所描绘的。CAR表达也在注入后的第71天，在患者UPN01血液中4.2%的T细胞表面上检测到，如图7所描绘的。[0314]接下来，利用抗-CAR个体基因型抗体MDA-647和图8所示的设门策略，多色流式细胞术用于实施更详细的研究，以进一步描述UPN03中CART19细胞的表达、表型和功能。基于CAR19表达观察到⑶8+和⑶4+细胞两者中记忆和活化标记的表达的明显差异。在第56天，CART19CD8+细胞首先显示与对抗原的延长和稳固的暴露一致的初级效应子记忆表型CCR7-⑶27-CD28-，如图4C所描绘的。相比之下，CAR-阴性⑶8+细胞由效应子和中心记忆细胞的混合物组成，在细胞亚型中CCR7表达，和在⑶27+⑶28-和⑶27+⑶28+分数中大的数字。尽管CART19和CAR-阴性细胞群两者都基本上表达⑶57,但该分子与PD-I在CARTl^H胞中一致地共表达，这是这些细胞的大量复制历史的可能反映。与CAR-阴性细胞群相比，CART19⑶8+群的整体缺少⑶25和⑶127两者的表达。到第169天，尽管CAR-阴性细胞群的表型保持类似于第56天样本，但CART19群已经演变成包含少量具有中心记忆细胞特征的群，值得注意地，CCR7表达，更高水平的⑶27和⑶28,以及为Η-1-阴性、CD57-阴性和⑶127-阳性的CAR+细胞。[0315]在⑶4+区室中，在第56天，CART19细胞的特征为在⑶57+和-区室两者内分布的一致缺少CCR7和⑶27+⑶28+PD-1+细胞占主导，并且基本上不存在⑶25和⑶127表达，如图4B所描绘的。相比之下，在该时间点上，CAR-阴性细胞在CCR7、CD27和PD-1表达方面是非均匀的heterogeneous，表达CD127并且也包含大量CD25+CD127-可能的调节T细胞群。到第169天，尽管⑶28表达在所有CAR+⑶4+细胞中保持一致地阳性，但一部分CART19⑶4+细胞已经向具有CCR7表达的中心记忆表型、更高百分比的⑶27-细胞、PD-I-阴性亚型的出现和⑶127表达的获得演变。CAR-阴性细胞保持与它们第56天的相应物合理地一致，除了⑶27表达的减少和⑶25+⑶127-细胞百分比的降低。[0316]在血液中，CARTl9细胞可在6个月后保持效应子功能[0317]除了短的持久性和不充足的体内增殖之外，利用CAR+T细胞的先前试验的限制还为体内注入的T细胞功能活性的快速丧失。患者UPN01和03中高水平CART19细胞持久性和CARl9分子的表面表达提供了直接测试从冷藏的外周血样本中恢复的细胞中的抗-CD19-特异性效应子功能的机会。来自患者UPN03的PBMC与对CD19表达为阳性或阴性的靶细胞一起培养图4dXART19T细胞的稳固⑶19-特异性效应子功能通过对⑶19-阳性而不是⑶19-阴性靶细胞的特异性脱粒证明，如由表面⑶I〇7a表达评估的。值得注意地，CART19群对⑶19-阳性靶的暴露诱导表面CAR-19的快速内化一一如图8所绘的，用于标准流式细胞术染色中相同效应子细胞中CAR19的表面表达。靶细胞上共刺激分子的存在不需要触发CART19细胞脱粒，因为NALM-6系不表达CD80或CD86Brentjens等，2007，ClinCancerRes1:5426-5435。效应子功能在注入后第56天明显，并在169天的时间点上保持。CAR+和CAR-T细胞的稳固效应子功能也可由药理学刺激证明。[0318]CART19细胞的临床活性[0319]任何患者中在注入后四天期间没有观察到显著的毒性，除了短暂的发热反应。然而，在首次注入后的7到21天之间，所有的患者随后发展显著的临床和实验室毒性。这些毒性是短期和可逆的。在治疗至今的三个患者中，根据标准准则，在CARTl注入后6个月具有2CR和IPRHallek等，2008，Blood111:5446。每个患者的过去病史和对疗法的应答的细节在图10中描绘。[0320]简单地说，患者UPN01在注入后10天开始形成发热综合征，伴随寒战和短暂的低血压。发热持续大约2周并得以解决;该患者还没有进一步的全身症状。该患者得到快速和完全缓解，如图5所描绘。在注入后1到6个月之间，在血液中通过流式细胞术没有检测到循环CLL细胞。通过形态学和流式细胞检测分析在CART19细胞注入后1、3和6个月的骨髓显示淋巴细胞浸润的持续不存在，如图5B所描绘的。注入后1和3个月的CT扫描显示腺病解决，如图5C所描绘的。在该报告时，完全缓和持续10+个月。[0321]患者UPN02用2个周期的苯达莫司汀和利妥昔单抗进行治疗，导致稳定的病情，如图5A所描绘的。该患者在CART19T细胞注入前接受第三剂苯达莫司汀作为淋巴耗尽化疗。该患者在首次注入后的第11天和第二CART19细胞加强的当天形成发热至40°C、寒战和呼吸困难，需要24小时住院治疗。发热和全身症状持续并在第15天，该患者具有短暂的心功能不全;在第18天开始皮质类固醇疗法后，所有症状解决。在CART19注入后，同时高热开始，该患者从外周血中快速清除P53-缺陷CLL细胞，如图5A所描绘的，和腺病部分减少，在治疗后一个月，骨髓显示持久性大量的CLL浸润，尽管有显著外周血细胞减少。该患者保持无临床症状。[0322]患者UPN03在CART19细胞注入前接受喷司他丁和环磷酰胺作为淋巴耗尽化疗。在化疗后三天但在细胞注入前，骨髓是细胞过多的（60%，大约50%牵涉CLL。该患者接受低剂量的CART19细胞（I.5XIO5个CAR+T细胞kg，分成3天）。此外，没有急性注入毒性。然而，在首次注入后14天，该患者开始具有寒战、发热、恶心和腹泻。到注入后的22天，诊断肿瘤溶解综合征，需要住院治疗。该患者已经解决全身症状，并在CART19注入1个月内，通过形态学、流式细胞术、细胞遗传学和FISH分析，该患者从血液和骨髓中已经清除循环CLL。CT扫描显示异常腺病解决，如图5B和5C所描绘的。从最初CART19细胞注入，完全缓和持续超过8个月。[0323]体内CART19效应子与CLL靶细胞比率的考虑[0324]临床前研究显示大肿瘤能够被切除，并且对于人源化小鼠中1:42的体内E:T比率，注入2·2XIO7个CAR能根除由IXIO9个细胞组成的肿瘤（Carpenito等，2009,ProcNatlAcadSciUSA106:3360-3365，尽管这些计算不考虑注射后T细胞的扩展。随时间的CLL肿瘤负荷的估计允许基于注入的CAR+T细胞数计算三个对象内得到的肿瘤减少和估计的CART19E:T比率。肿瘤负荷通过测量骨髓、血液和次级淋巴组织中的CLL负载进行计算。如图10所示的基线肿瘤负荷指示每个患者在CART19注入前具有IO12数量级的CLL细胞S卩，1千克肿瘤负载）。患者UPN03在第-1天即化疗后和CART19注入前在骨髓中具有8.8XIO11个CLL细胞的估计的基线肿瘤负荷，和次级淋巴组织中3.3-5.5XIO11个CLL细胞的测量的肿瘤质量，这取决于体积CT扫描分析的方法。考虑到UPN03仅被注入1.4XIO7个CART19细胞，利用最初总肿瘤负荷（I.3XIO12个CLL细胞的估计，并且没有CLL细胞在治疗后是可检测到的，得到惊人的1:93，000E:T比率。通过类似的计算，对UPN01和UPN02，计算有效的体内E:T比率为1:2200和1:1000，如表3所示）。最后，通过CART19T细胞的连续杀死的贡献，联合1，〇〇〇-倍的体内CART19扩展，可能有助于由CART19细胞介导的强大的抗-白血病效应。[0325]T细胞表达嵌合受体在具有晚期白血病的患者中建立记忆和有效的抗肿瘤效应[0326]CAR的有限的体内表达和效应子功能是测试第一代CAR的试验中的中心限制Kershaw等，2006，ClinCancerRes12:6106-6115;Lamers等，2006，JClin0ncol24:e20-e22;Till等，2008，Blood，112,226卜2271;Park等，2007，MolTher15:825833;Pule等，2008，NatMed14:1264-1270。基于证明包含4-1BB信号传导模块的CAR提高的持久性的临床建模（Milone等，2009，M〇1Ther.17:1453-1464;Carpenito等，2009，ProcNatlAcadSciUSA106:3360-3365，设计实验以形成用慢病毒载体技术工程改造的第二代CAR。发现该第二代CAR在慢性HIV感染环境中是安全的（Levine等，2006，ProcNatlAcadSciUSA103:17372-17377。本结果显示当该第二代CAR在T细胞中表达并在被设计以促进中心记忆T细胞的移入的条件下培养时（Rapoport等，2005，NatMed11:1230-1237;Bondanza等，2006，Bloodl07:1828-1836，观察到与先前报告相比注入后改善的CART细胞扩展。CART19细胞建立了CD19-特异性细胞记忆，和以先前没有实现的体内E:T比率杀死肿瘤细胞。[0327]CART19为并入4-1BB信号传导结构域的第一个CAR试验并第一次使用慢病毒载体技术。本结果证明有效跟踪CAR至肿瘤位点，实际上建立显示⑶19特异性的“肿瘤浸润淋巴细胞”。显著的体内扩展允许首次证明从患者中直接回收的CAR可保持体内效应子功能数月。先前的研究已经提示优选对初级T细胞，将第一代CAR引入病毒特异性T细胞Pule等，2008，NatMed14:1264-1270，然而第二代CAR引入最佳共刺激的初级T细胞的结果使该观念被质疑。不希望被任何具体的理论所束缚，提出警告注意：随着所有三位患者中千克大小的肿瘤负荷溶解，伴随患者中的两位中可能的危险的高水平细胞因子的延迟释放，临床效应是深远和前所未有的。没有观察到经典的细胞因子风暴storm效应。然而，本研究被设计以通过在三天时间中慎重注入CARTl9减轻该可能性。[0328]发现非常低剂量的CAR可引起有效的临床应答。这是证明CART19载体设计的安全性的试验性研究。低于先前试验中测试的那些几个数量级的CART19细胞剂量可具有临床益处的观察可对未来在更宽规模上CAR疗法的执行和测试针对非CD19的标靶的CAR的试验设计具有重要含意。[0329]本研究进一步指出CART19在中心记忆和效应子T细胞两者中都表达，并且与先前的报告相比，这可能有助于它们的长期存活。不希望被任何具体的理论所束缚，CART细胞可在遇到和随后消除表达替代抗原的靶细胞例如CLL肿瘤细胞或正常B细胞后，体内分化成中心记忆样状态。确实地，已经报告4-1BB的信号传导在TCR信号传导的内容中促进记忆的发展（Sabbagh等，2007，TrendsTmmunol28:333-339〇[0330]CART19扩大的增殖和存活已经显示先前还没有报道的CART细胞的药学动力学的方面。观察到血清和骨髓中的细胞因子释放动力学与峰值CART19水平相关，所以可能当表达CD19的细胞标靶变得有限时，开始延迟。CART19的扩大存活的机制可能涉及上述4-1BB结构域的并入或通过天然TCR和或CAR的信号传导。一个令人感兴趣的可能性是扩大的存活与已经在骨髓标本中识别的CART19群相关，这提出了⑶19CAR能通过遇到骨髓中的B细胞祖细胞progenitor保持的假说。涉及该问题的是什么促使体内CART19细胞的最初扩展？极少的例外（Savoldo等，2011，JClinInvestdoi:10.1172JCI46110;Pule等，2008，NatMedl4:1264-1270，本研究是唯一的省略1L-2注入的试验，以便CART19细胞有可能响应稳态细胞因子被扩展或更有可能地响应白血病标靶和或正常B细胞上表达的CD19而被扩展。在后一种情况下，这可为针对正常APC上的标靶，诸如⑶19和⑶20,的CAR的有吸引力的特征，因为CART19的自我更新有可能发生在正常细胞上，这通过“自接种加强”的手段提供了CAR记忆的机制，和因此长期肿瘤免疫监督。该CART19稳态的机制可需要进一步的研究，以阐明持久性的细胞内在和外在机制。在这些结果前，多数研究者已经将CAR疗法视为临时形式的免疫疗法，然而具有优化的信号传导结构域的CAR可起到缓和诱导和巩固两者的作用，以及用于长期免疫监督。[0331]在所有三位患者一一包括两位具有P53缺陷白血病的患者一一中已经观察到有效的抗-白血病效应。先前利用CAR的研究有困难将抗肿瘤效应从淋巴耗尽化疗中分开。然而，同时发生的并且可能依赖于本研究中体内CAR扩展的与氟达拉滨-难治疗的患者中肿瘤溶解动力学联合的延迟的细胞因子释放，指示CART19介导有效的抗肿瘤效应。本结果不排除化疗在增强CAR效应方面的作用。[0332]可需要载体、转基因和细胞制造程序与来自其他中心的正在进行研究的结果的彻底比较，以得到获得体内CART细胞的持续功能需要的关键特征的完全理解。不像抗体疗法，CAR-修饰的T细胞具有体内复制的潜力，和长期持久性开导致持续的肿瘤控制。由非交叉抗性杀手T细胞组成的现成疗法的可利用性具有改善具有B细胞恶性肿瘤的患者的结果的潜力。例如，利用试剂诸如利妥昔单抗和贝伐单抗的抗体疗法的限制在于该疗法需要重复的抗体注入，那是不方便和昂贵的。具有在CARTl细胞的单一注入后在T细胞上表达的抗-⑶19scFv的延长抗体疗法的递送delivery在该例子中，治疗至今的3位患者中的3位持续至少6个月）具有许多实践优点，包括方便性和成本节约。[0333]实施例2:慢性淋巴白血病中的嵌合抗原受体-修饰的T细胞[0334]设计慢病毒载体，其表达具有对B-细胞抗原CD19特异性、与CD137T细胞中的共刺激受体[4-1BB]和CD34T-细胞抗原受体的信号-转导部件信号传导结构域结合的嵌合抗原受体。观察到再输注入具有难治疗的慢性淋巴细胞白血病CLL的患者的低剂量大约1.5XIO5个细胞每千克体重）的自体嵌合抗原受体-修饰的T细胞扩展至超过体内最初移入水平1000倍的水平。也观察到该患者显示肿瘤溶解综合征的延迟发展和完全缓和。[0335]除了肿瘤溶解综合征，涉及嵌合抗原受体T细胞的仅其他等级34毒性的效应为淋巴细胞减少。被工程改造的细胞在血液和骨髓中持续高水平至少6个月，并继续表达嵌合抗原受体。特异性免疫应答在骨髓中检测出，伴随表达CD19的正常B细胞和白血病细胞的损失。在治疗后缓和持续10个月。低丙种球蛋白血症是预料的慢性毒性效应。[0336]现在描述用于这些实验的材料和方法。[0337]材料和方法[0338]研究程序[0339]设计自身非活化慢病毒载体GeMCRTS0607-793，其受到临床前安全性测试，如先前报告的Milone等，2009，M〇1Ther，17:1453-64。先前也已经描述了T细胞制备的方法Porter等，2006，Blood，107:1325-31。进行定量聚合酶链反应PCR分析，以检测血液和骨髓中的嵌合抗原受体T细胞。定量的下限根据标准曲线确定;低于定量下限的平均值BP，可报告但不可量化的被考虑为近似的。测定的定量下限为25个拷贝每微克的基因组DNA。[0340]使用被分成等分试样用于单次使用并保存在-80°C的来自全血和骨髓的血清，进行可溶因子分析。通过使用Luminex珠-阵列技术和反应物LifeTechnologies进行可溶细胞因子的量化。[0341]单采血液成分术#1[0342]在单采血液成分术中心进行12-15升单采血液成分术程序。在该程序期间，获得外周血单核细胞I3BC用于生产CART-19T细胞。从单一白细胞提取法中收获至少50XIO9个白细胞，以制造CART-19T细胞。也获得和冷藏基线血液白细胞。[0343]细胞减少性cytoreductive化疗[0344]化疗在注入前大约5-10天开始，以便在化疗完成后1-2天，可给出CART-19细胞。因此，化疗开始的时机取决于方案的长度。化疗的目的是诱导淋巴细胞减少，以便于CART-19细胞的移入和稳态扩展。也可选择化疗，以减少疾病肿瘤负荷。由社区肿瘤学家选择和施用细胞减少性化疗。化疗的选择取决于该患者潜在的疾病和之前的疗法。氟达拉滨30mgm2天X3天和环磷酰胺300mgm2天X3天是选择的试剂，因为在促进过继免疫疗法中使用这些试剂具有最多的经验。利用FDA批准的药物的一些其他可接受方案是适当的，包括CHOP、HyperCVAD、EPOCH、DHAP、ICE或其他方案。[0345]再分级评估[0346]在化疗完成时进行有限的再分级，以便提供基线肿瘤负荷测量值。这包括成像、身体检查和最小残余疾病MRD评估。对象经历以下，以进行注入前测试:身体检查、不利事件记录和血液抽取，用于血液学、化学和妊娠测试如果是合适的话）。[0347]CART-19T细胞的制备[0348]自体T细胞被工程改造以表达对⑶19具有特异性的细胞外单链抗体scFv。细胞外scFv可改变转导的T细胞对表达CD19的细胞的特异性，后者是一种在恶性细胞的表面上和正常B细胞上表达受限制的分子。除了⑶19scFv之外，细胞还被转导以表达由TCRG链或者由4-1BB和TCRG信号传导模块组成的串联信号传导结构域中任一个组成的细胞内信号传导分子。scFv源自小鼠单克隆抗体，并因此包含小鼠序列，并且信号传导结构域完全是天然人序列的。CART-19T细胞通过由单采血液成分术分离T细胞并使用慢病毒载体技术制造Dropulic等，2006，HumanGeneTherapy，17:577-88;Naldini等，1996，Science，272:263-7;Dul1等，1998，JVirol，72:8463-71，以将scFv:ΤΟ?ζ:4-1BB引入CD4和CD8T细胞。在一些患者中，将对照scFV:TCI^:引入一部分细胞，用于竞争性再群体化实验。这些受体是“普遍的”，因为它们以MHC-非依赖性方式结合抗原，因此，一种受体构建体可用于治疗具有CD19抗原-阳性肿瘤的患者群体。[0349]CAR构建体在宾夕法尼亚大学研发，和临床级载体在Lentigen公司制造。CART-19细胞根据图11显示的方法在宾夕法尼亚大学的临床细胞和疫苗生产设备中制造。在细胞培养结束时，细胞被冷藏在可注入的冷冻培养基。以1个或2个袋，施用包括2.5XIO9至5XIO9个总细胞注入的单一剂的CART-19转导的T细胞。每个袋包含冷冻培养基的等分试样体积决定于剂量），其以下可注入级的反应物（％vv:31.25plasmalyte-A、31.25右旋糖5%、0·45NaCl、上至7·50的DMSO、I·00葡聚糖40、5·00人血清白蛋白，大约2·5-5XIO9个自体T细胞每袋。为了增加安全性，首次剂量在第〇天、第1天和第2天以分次剂量给予，第0天为大约10%的细胞，第1天为30%的细胞和第2天为60%的细胞。[0350]储存[0351]包含CART-19-转导的T细胞的袋10至IOOml容量被储存在血库条件下受监测的-135°C冷冻室中。注入袋被储存在冷冻室中，直到需要。[0352]细胞解冻[0353]在记录研究性药房中的细胞后，冷冻的细胞在干冰中被运送至对象的床边。在使用保持在36°C至38°C的水浴时，细胞在床边解冻一袋。该袋被温和地按摩，直到细胞刚好解冻。不应有冷冻块留在容器内。如果CART-19细胞产物显示处于损坏或泄漏的袋，或以其他方式显示受损害，则它不应被注入。[0354]术前用药法[0355]T细胞注入后的副作用可包括短暂的发热、冷颤和或恶心。推荐对象在注入CART-19细胞前，通过口服醋氨酚650mg和口服或IV盐酸苯海拉明25-50mg进行预用药。这些药物处理在需要时可每六个小时进行重复。如果该患者持续发热，没有由醋氨酚缓解，则可采用非甾类的抗炎性药物的疗程。推荐患者在任何时间都不接受全身性皮质类固醇类诸如氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙（甲强龙制剂（SoIu-Medrol或地塞米松（地卡特隆Decadron，除了在威胁生命的紧急情况下，因为这可对T细胞产生反作用。如果需要皮质类固醇类进行急性注入反应，则推荐IOOmg最初剂量的氢化可的松。[0356]施用注入[0357]在完成化疗后1至2天开始注入。首次注入当天，患者具有有差异的CBC，和⑶3、⑶4和CD8计数的评估，因为给出的化疗部分上诱导淋巴细胞减少。不希望被任何具体的理论所束缚，相信2.5-5XIO9个CART-19细胞的最初i.V.剂量对于该方案是最优的。因为健康的成人具有大约IXIO12个T细胞，所以建议的总剂量等于细胞总体质量的大约0.5%Roederer，1995，NatMed，l:621-7;Macallan等，2003，EurJImmunol，33:2316-26。第一剂量利用第0天（10%、第1天30%和第2天60%的分次剂量施用。对象在隔离室中接受注入。细胞如本文其他地方描述的在该患者床边解冻。以能容忍地快速注入速度给予解冻的细胞，以便注入持续大约I〇-15分钟。转导的T细胞通过以大约IOmL至20mL每分钟的流速通过具有三通旋塞的18-规格的不含乳胶的Y-型输血器的快速静脉内注入进行施用。注入持续大约15分钟。一袋或两袋CART-19修饰的细胞在冰上输送，和该细胞在还是冷的时被施用给对象。在接受CART-19细胞混合物的对象中，为了便于混合，利用Y-转接器Y-adapter同时施用细胞。对象如本文其他地方所述的进行注入和预用药。在给药前、注入结束时和此后每15分钟持续1个小时并且直到这些是稳定的和令人满意的，进行评估对象的生命体征和进行脉搏血氧测定。在注入前和在注入后20分钟获得确定基线CART-19水平的血液样本。从他们之前的细胞减少性化疗中经历毒性的患者，他们的注入安排延迟，直到解决这些毒性。许可T细胞注入延迟的具体毒性包括：1肺部的：要求补充氧以保持多于95%的饱和或胸部X-射线上存在进行性的放射照相异常;2心脏的：不受医学处理控制的新的心律失常;3需要增压支持的低血压;4主动感染:在T细胞注入48小时内细菌、真菌或病毒的阳性血液培养物。在首次注入前以及每个随后注入后两个小时收集钾和尿酸的血清样本。[0358]注入后实验室，以评估移入和持久性[0359]对象在最初CART-19细胞注入后第4天和第10天返回，以抽取血液，用于血清细胞因子水平，和CART-19PCR，以便评估CART-19细胞的存在。对象每周一次返回，持续三周，以经历以下：身体检查、不利事件的记录和血液抽取，用于血液学、化学、CART-19细胞的移入和持久性、和研究化验researchlab〇[0360]第二注入[0361]不希望被任何具体的理论所束缚，相信可在第11天给予患者第二剂CART-19细胞，条件是它们显示对第一剂的充分耐受，和制造足够的CART-19细胞。该剂为2-5XIO9个总细胞。在注入后两个小时可收集钾和尿酸的血清样本。[0362]第二单采血液成分术[0363]在单采血液成分术中心，进行2升单采血液成分术程序。获得PBMC用于研究并冷藏。实验对象经历以下：身体检查、不利事件的记录和血液抽取，用于血液学、化学、CART-19细胞的移入和持久性、和研究化验。另外，进行再分级，以便提供了肿瘤负荷测量值。再分级测试由疾病类型确定，并包括成像、MRD评估、骨髓吸取和活组织检查和或淋巴结活组织检查。[0364]注入后2至6个月的每月评估[0365]对象在CART-19细胞注入后，在2至6个月期间每月返回。在这些研究访问中，对象经历以下：伴随施药、身体检查、不利事件的记录和血液抽取，用于血液学、化学、CART-19细胞的移入和持久性、和研究化验。HIVDNA测定在CART-19细胞注入后2-6个月进行，以排除可检测的RCL的存在。[0366]在注入后每季评估直到2年[0367]对象在注入后在每季进行评估，直到2年。在这些研究访问中，实验对象经历以下：伴随施药、身体检查、不利事件的记录和血液抽取，用于血液学、化学、CART-19细胞的移入和持久性、和研究化验。HIVDNA测定在CART-19细胞注入后3个月和6个月进行，以排除可检测的RCL的存在。[0368]现在描述实验结果。[0369]患者病史[0370]该患者在1996年接受第I阶段CLL的诊断。他在6年的观察后首次需要治疗进行性白细胞增多和腺病。在2002年，他用两个周期的利妥昔单抗加氟达拉滨进行治疗;该治疗导致血细胞计数的正常化和腺病的部分解决。在2006年，他因疾病进展接受四个周期的利妥昔单抗和氟达拉滨，再次血细胞计数正常化和腺病部分恢复regression。该应答后后是20个月无进展间隔时间和2年无治疗间隔时间。在2009年2月，他具有快速进行性白细胞增多和复发的腺病。他的骨髓被CLL大量浸润。细胞遗传学分析显示15个细胞中的3个包含染色体17p的缺失，和荧光原位杂交FISH测试显示200个细胞中的170个具有包括染色体17p上TP53的缺失。他接受利妥昔单抗和苯达莫司汀一个周期和没有利妥昔单抗（因为严重的变应性反应的苯达莫司汀的三个额外的周期。该治疗仅产生短暂的淋巴细胞增多的改善。进行性腺病在治疗后利用计算断层照相法CT进行记录。[0371]自体T细胞利用白细胞提取法收集并冷藏。该患者随后接受阿仑单抗抗-CD52,成熟的淋巴细胞，细胞-表面抗原）11周，具有改善的造血作用并且腺病部分解决。在接下来的6个月内，他病情稳定，具有持续、大量的骨髓牵涉和具有多个1至3-cm淋巴结的扩散腺病。在2010年7月，该患者被招入嵌合抗原受体-修饰的T细胞的第1阶段临床试验中。[0372]细胞注入[0373]来自该患者的自体T细胞被解冻并用慢病毒转导，以表达CD19-特异性嵌合抗原受体图12A;在表5中描绘了针对慢病毒载体和有关序列的序列识别符。在细胞注入前四天，该患者接受设计用于耗尽淋巴细胞的化疗（4mg每平方米身体表面积剂量的喷司他丁和600mg每平方米剂量的环磷酰胺），而不使用利妥昔单抗Lamanna等，2006,JClinOncol，24:1575-81。在化疗后三天但在细胞注入前，骨髓是细胞过多的，大约40%牵涉CLL。白血病细胞表达κ轻链和⑶5、⑶19、CD20和⑶23。细胞遗传学分析显示两种单独的克隆，两者都导致染色体17p和TP53基因座的丧失（46，XY，del17pl2[5]46，XY，der17t17;21ql0;ql0[5]46，XY[14]。在化疗后四天，该患者接受总共3X108个T细胞，其中的5%被转导，总共1.42XIO7个转导的细胞（1.46XIO5个细胞每千克分成三个连续的每日静脉内注入第1天为10%、第2天为30%和第3天为60%。没有施用注入后细胞因子。没有记录到注入的毒性效应。[0374]表5:pELPS-CD19_BBz转移载体的序列标识符[0375][0376][0377]临床应答和评估[0378]在首次注入后十四天，该患者开始有冷颤和与2级疲劳相关的低等级的发热。在接下来的5天内，冷颤加重，并且他的温度升高至39.2°C102.5°F，伴随寒战、发汗、厌食、恶心和腹泻。他没有呼吸或心脏症状。因为发热，进行胸部放射照相和血液、尿和粪便培养物，并且都是阴性或正常的。在注入后第天22,诊断肿瘤溶解综合征（图12B。尿酸水平为10.611^每分升630.5以1]1〇1每升），磷水平为4.711^每分升（1.51]11]1〇1每升）（正常范围，2.4至4.7mg每分升[0.8至1.5mmol每升]，和乳酸脱氢酶水平为1130U每升正常范围，98至192。有急性肾损伤的证据，肌酸酐水平为2.60mg每分升229.8μπι〇1每升）（基线水平，〈I.Omg每分升[88,4μπι01每升]。该患者被送院并用流体复苏和拉布立酶进行治疗。尿酸水平在24个小时内返回至正常范围，和肌酸酐水平在3天内返回至正常范围；他在医院第4天获准离开。乳酸脱氢酶水平逐步降低，在随后的月份内变得正常。[0379]到CART19-细胞注入后的第28天，腺病不再明显，并且在第23天，骨髓中没有CLL的证据图12C。核型现在在15个细胞中的15个46，ΧΥ中正常，和对于检查的200个细胞中的198个缺失TP53，FISH测试是阴性的；这考虑为处于阴性对照的正常限度内。流式细胞检测分析显示无残余的CLL，和B细胞是不可检测的（在⑶5+⑶10-⑶19+⑶23+淋巴细胞门内〈1%的细胞）。注入后第31天进行的CT扫描显示腺病解决（图12D。[0380]在CART19-细胞注入后三个月和六个月，身体检查保持寻常，没有明显的腺病，和在CART19-细胞注入后3个月进行的CT扫描显示持续缓和（图12D。利用形态学分析、核型分析46，XY或流式细胞检测分析，在3个月和6个月的骨髓研究也显示没有CLL的证据，也持续缺少正常B细胞。缓和已经持续至少10个月。[0381]CART19细胞的毒性[0382]细胞注入没有急性毒性效应。唯一记录的严重的（等级3或4不利事件是上述的第3级肿瘤溶解综合征。该患者具有在基线上的1级淋巴细胞减少，和在治疗后第1天开始并继续至少10个月的第2或3级淋巴细胞减少。在天19记录4级淋巴细胞减少，其具有140个细胞每立方毫米的绝对淋巴细胞计数，但从第22天至至少10个月，绝对淋巴细胞计数处于390和780细胞每立方毫米2或3级的淋巴细胞减少之间的范围内。该患者从第19天至第26天具有短暂的1或2级血小板减少血小板计数，98，000至131，000个每立方毫米和从第17天至第33天具有1或2级的中性白细胞减少症绝对中性白细胞计数，1090至1630每立方毫米）。可能与研究治疗相关的其他迹象和症状包括1和2级的氨基转移酶和碱性磷酸酶水平升高，其在首次注入后17天形成并在第33天解决，1和2级的由发热、冷颤、发汗、肌痛、头疼和疲劳组成的全身症状。2级低丙种球蛋白血症用注入静脉内免疫球蛋白校正。[0383]血清和骨髓细胞因子的分析[0384]该患者的临床应答伴随炎性细胞因子水平的延迟增加（图13A至图13D，干扰素-γ水平、干扰素-γ-反应趋化因子CXCL9和CXCLlO和白细胞介素-6是基线水平的160倍高。T细胞因子水平的短暂升高与临床症状对应，在首次CART19-细胞注入后17至23天达到峰值。[0385]测量来自系列骨髓吸取物的上清液的细胞因子并显示免疫活化的证据（图13Ε。记录了与在T-细胞注入前的日子的基线水平相比，干扰素-γ、CXCL9、白细胞介素-6和可溶白细胞介素-2受体的显著增加;该值在首次CART19-细胞注入后的第23天达到峰值。骨髓细胞因子增加与白血病细胞从骨髓中消失一致。血清和骨髓肿瘤坏死因子α保持不变。[0386]嵌合抗原受体T细胞的扩展和持久性[0387]在首次注入后的第1天开始，实时PCR检测编码抗-CD19嵌合抗原受体CAR19的DNA图14Α。到注入后的第21天，记录体内多于3-log扩展的细胞。在峰值水平上，血液中的CART19细胞占了多于20%的循环淋巴细胞;这些峰值水平与全身症状的发生、肿瘤溶解综合征（图12B和血清细胞因子水平升高（图13A至图13D同时。CART19细胞在注入后6个月保持在高水平上可检测，尽管该值从峰值水平降低10倍。血液中嵌合抗原受体T细胞的加倍时间为大约1.2天，消除半衰期为31天。[0388]骨髓中的嵌合抗原受体T细胞[0389]CART19细胞在首次注入后23天开始在骨髓标本中识别到（图14B和持续至少6个月，衰减半衰期为34天。骨髓中最高水平的CART19细胞在首次注入后23天的首次评估中识别到并与免疫应答的诱导同时，如细胞因子-分泌分布图所指示的（图13E。骨髓吸取物的流式细胞检测分析指示CD5+CD19+细胞的克隆扩展处于基线，其在注入后1个月和注入后3个月获得的样本中缺失数据未显示）。正常B细胞在治疗后没有检测到（图14C。[0390]利用自体基因修饰的CART19细胞的治疗[0391]本文描述的是在通过用表达连接至⑶3-ζ和⑶1374-1BB信号传导结构域的抗-CD19的慢病毒载体转导，对自体T细胞基因修饰以靶向CD19的治疗后3周，肿瘤溶解综合征的延迟发展和完全缓解。基因修饰细胞在注入后以高水平存在在骨髓中，持续至少6个月。骨髓中CD19-特异性免疫应答的产生通过与嵌合抗原受体T细胞的峰值浸润同时的细胞因子的短暂释放和白血病细胞的去除证明。先前还没有报道在细胞免疫疗法后肿瘤溶解综合征的发展（Baeksgaard等，2003,CancerChemotherPharacol，51:187-92〇[0392]自体T细胞对靶特异性肿瘤抗原的基因操纵是癌症疗法的有吸引力的策略Sadelain等，2009，CurrOpinImmunol，21:215_23;Jena等，2010，B1⑻d，116:1035_44。本文描述的方法的重要特征是嵌合抗原受体T细胞可以以HLA-不受限制的方式识别肿瘤标靶，以便“现成”嵌合抗原受体可对具有多种组织学特征的肿瘤构建。HIV-源的慢病毒载体用于癌症疗法，这是一种可能相比逆转录病毒载体的使用具有一些优点的方法June等，2009,NatRevImmunol,9:704-16〇[0393]在嵌合抗原受体T细胞的先前试验中，目标肿瘤应答是适度的，并且修饰细胞的体内增殖是不持久的（Kershaw等，2006，ClinCancerRes，12:6106-15;Till等，2008，Blood，112:2261-71;Pule等，2008，NatMed，14:1264-70C3Brentjens和同事们报告了连接至CD28信号传导结构域的靶向CD19的嵌合抗原受体的临床试验的初步结果，并发现具有晚期CLL的三个患者中的两个的短暂肿瘤应答Brentjens等，2010，M〇1Ther，18:666-8;然而，嵌合抗原受体快速从循环中消失。[0394]出乎意料地，注入的非常低剂量的嵌合抗原受体T细胞将产生临床明显的抗肿瘤应答。确实地，1.5XIO5个嵌合抗原受体T细胞每千克的注入剂量低于在修饰以表达嵌合抗原受体或转基因T-细胞受体的T细胞的先前研究中使用的剂量几个数量级（Kershaw等，2006，ClinCancerRes，12:6106_15;Brentjens等，2010，M〇1Ther，18:666_8;Morgan等，2010，MolTher，18:843-51;Johnson等，2009，Blood，114:535-46。不被任何具体的理论所支持，推测该化疗可增强嵌合抗原受体的作用。[0395]患者血液和骨髓中CART19细胞的延长持久性由于包括4-1BB信号传导结构域。因为不排斥表达包含鼠科序列的单链Fv抗体片段的CART19细胞，所以有可能CART19-细胞-介导的正常B细胞的消除促进诱导对嵌合抗原受体的免疫耐受，。考虑到在该患者中缺少可检测的CD19-阳性白血病细胞，并且不被任何具体的理论所支持，有可能至少部分从由早期B-细胞祖细胞传递的刺激，实现嵌合抗原受体T细胞的稳态一一因为它们开始出现在骨髓中。本发明涉及可存在保持“记忆”嵌合抗原受体T细胞的新机制的发现。[0396]尽管CD19是有吸引力的肿瘤标靶，但是表达限于正常和恶性B细胞，有对嵌合抗原受体T细胞的持久性可介导长期B-细胞缺乏的担忧。实际上，在该患者中，在注入后，B细胞不存在于血液和骨髓中至少6个月。该患者不具有复发感染。用利妥昔单抗通过CD20靶向B细胞对于具有B-细胞瘤的患者是有效和相对安全的策略，并且长期B-细胞淋巴细胞减少是易处理的Molina，2008，AnnRevMed，59:237-50。已经报道用利妥昔单抗治疗的患者在疗法中止后的数月内B细胞恢复。还不清楚这样的恢复是否在抗B-细胞T细胞在体内持续的患者中发生。[0397]具有TP53缺失的CLL的患者在标准疗法后具有短期缓和Dohner等，1995,Blood，85:1580-9。同种异基因的骨髓移植是在具有晚期CLL的患者中诱导长期缓和的唯一方法Gribben等，2011，BiolBloodMarrowTransplant，17:Suppl:S63_S70。然而，因为高频率的慢性移植-对-宿主疾病一一其在通常受CLL影响的年长患者中经常是特别严重的Gribben等，2011，BiolBloodMarrowTransplant，17:Suppl:S63-S70;Sorror等，2008，Blood，111:446-52，所得的有效的移植-对-肿瘤效应与相当大的发病率相关。本文提供的数据提示基因修饰的自体T细胞可避免该限制。[0398]肿瘤溶解综合征和细胞因子分泌的延迟开始，联合有力的体内嵌合抗原受体T-细胞扩展和显著的抗白血病活性，指出CART19细胞的大量和持续的效应子功能。本文描述的实验强调该疗法的效力并提供了通过连接至有效信号传导结构域的嵌合抗原受体的转导，对自体T细胞基因修饰以靶向CD19和其他标靶）的详细研究的支持。不像抗体-介导的疗法，嵌合抗原受体-修饰T细胞具有体内复制的潜力，并且长期持久性能导致持续的肿瘤控制。另两位具有晚期CLL的患者也已经根据该方案接受CART19注入，并且所有三位都已经具有肿瘤应答。这些发现确保针对B-细胞瘤的CD19-改变的T细胞的继续研究。[0399]本文引用的每一和每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此都通过引用全文并入。尽管已经参考具体实施方式公开了本发明，但显而易见的是可由本领域技术人员设计本发明的其他实施方式和变形，而不脱离本发明的真实精神和范围。权利要求意欲被解释为包括所有这样的实施方式和等同变形。

权利要求：1.编码嵌合抗原受体CAR的分离的核酸序列，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3G信号传导结构域，其中所述CD3G信号传导结构域包括SEQIDNO:24的氨基酸序列。2.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述CAR包括SEQIDN0:12的氨基酸序列。3.权利要求1所述的分离的核酸序列，其包括SEQIDNO:8的核酸序列。4.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述抗原结合结构域为抗体或其抗原-结合片段。5.权利要求4所述的分离的核酸序列，其中所述抗原-结合片段为Fab或scFv。6.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原。7.权利要求6所述的分离的核酸序列，其中所述肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。8.权利要求6所述的分离的核酸序列，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关。9.权利要求6所述的分离的核酸序列，其中所述肿瘤抗原选自⑶19、CD20、⑶22、R0R1、间皮素、CD33IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ES0-lTCR、MAGEA3TCR和其任何组合。10.权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述共刺激信号传导区包括共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-1、IC0S、WE细胞功能相关抗原-ILFA-I02工07丄16!11'、疆62：、87-!13、与〇83特异性结合的配体和其任何组合。

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