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申请/专利权人：深圳新赛尔生物科技有限公司

摘要：本发明涉及一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，包括步骤：对获得的子宫内膜组织材料进行预处理；然后加入含有多肽的消化液，消化获得单细胞悬液；并对其进行原代培养和传代培养；即获得所述子宫内膜干细胞。本发明提供方法操作简单，获得的子宫内膜干细胞存活率高、传代效率高而且在培养过程中具有较高的增殖能力，干细胞表面标志物表达良好，能够对子宫内膜干细胞进行规模化的制备，为未来子宫内膜干细胞及其在相关疾病治疗的研究与临床应用的开展奠定良好基础。

主权项：1.一种子宫内膜干细胞的分离提取和培养方法，包括以下步骤：（1）在无菌条件下取内膜全层+子宫肌层5mm，取材远离病变部位，剪至1mm3大小并放置在培养基内，并向培养基内加入1％的生理盐水和样本浸泡液进行浸泡，浸泡完成后利用生理盐水溶液对子宫内膜组织上残存的血液进行清洗；（2）清洗完成后放置消化瓶内，并向消化瓶内加入0.2％胰蛋白酶溶液进行消化，消化后放入离心机内进行离心，并去除上层清溶液；（3）取步骤（2）离心后的组织破碎，并按质量体积比加入0.1％的消化液50mL，并置于恒温振荡仪内持续消化过夜得到消化液，然后利用100目筛网过滤消化液；（4）利用生理盐水溶液将滤网过滤出的子宫内膜细胞冲入离心容器内，以5000rmin离心10min对子宫内膜溶液进行离心，取出上层清液，并将底层的细胞移植至含有10％胎牛血清的DMEMF12培养基内进行培养；（5）利用培养基将细胞培养贴壁60％后把培养基转移到无菌环境下将细胞接种至接种瓶内，并将接种瓶移植到CO2孵箱内培养；（6）每2天换液一次，获得的细胞长到80％融合时，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化1h，待胞质回缩，加含10％（VV）胚牛血清的DMEMF12培养液终止消化；（7）将步骤（6）的消化液5000rmin离心10min，原代细胞以1:1的比例进行传代，记为P1代，传代第二天培养液换液，每天向传代培养基中加入20-40重量份的生长刺激液，P2代以后按1:10的比例传代，继续培养至P5～15代，即得所述子宫内膜干细胞的传代培养细胞；其中，步骤（3）所述消化液为质量百分含量为0.2％的I型胶原酶和多肽溶液，所述Ⅰ型胶原酶和多肽溶液的体积比为5-20:1，多肽的氨基酸序列为MSGKPST或GSTYAA或SDAAPFN；步骤（1）所述的样本浸泡液为含有20～200UmL青霉素、0.2～2.0mgmL链霉素和0.1～1.0mgmLEDTA-Na2的PBS缓冲液；在步骤（7）中所述生长刺激液由以下重量份的组分组成：5-10份的甘露醇、1-2份的PDGF、2-5份的维生素C、2-5份的HEPES和5-10份的氯化钠。

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