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申请/专利权人：西部生科生物医学科技(成都)有限公司双流医疗分公司

摘要：本发明属于生物科技领域，主要涉及一种脂肪干细胞工艺，具体涉及一种制备人体脂肪干细胞制剂的工艺及临床应用。本发明使用易获得以及免疫排斥反应较低的脂肪干细胞悬液，与短双歧杆菌ATCC15701和植物乳杆菌AS1.555，对枸杞、茶叶和甜菜根进行有氧无氧协同发酵得到的发酵物上清液混合得到脂肪干细胞抗衰老注射剂，采用脂肪干细胞提高受损细胞生命力、拮抗细胞凋亡，具有促进血管形成、组织修复进行内源性抗衰老，同时结合发酵产物中的枸杞多糖、茶多酚以及烟酰胺核苷等能够抗紫外线的作用进行外源性抗衰老，对皮肤抗衰老相关的医美行业具有重要意义。

主权项：1.一种制备人体脂肪干细胞制剂的工艺，其特征在于：具体制备方法如下：S1、脂肪干细胞ADSCs的活化与培养：从液氮或-80℃冰箱中取出冻存的脂肪干细胞，快速将冻存管放入37℃水浴中迅速解冻，将解冻后的细胞转移到含有其5-10倍体积的培养基的离心管中，即含体积分数20%胎牛血清、100UmL链青霉素的LG-DMEM培养基，在1200-1500rmin下离心5min，然后用含体积分数20%胎牛血清、100UmL链青霉素的LG-DMEM培养基重悬细胞，以3×106-4×106个ml的细胞密度将细胞接种至T25培养瓶中，于37℃、5%CO2，培养箱中培养，培养72h后，首次全量换液，此后每3d换液一次，直至原代细胞融合度达到80%~90%时，用0.25%胰酶消化，按1:3传代；S2、脂肪干细胞ADSCs上悬液的制备：取生长状况良好的第3代ADSCs以1×106个ml细胞的密度接种至T25胞瓶中，待细胞融合度达到70-80%时，用0.05%胰酶消化成细胞悬液并计数，1000rmin离心5分钟后均用0.5ml的PBS液重悬，将细胞终浓度调整为2×106ml备用；S3、菌液的制备：制备浓度为3.1×109-5.2×109cfuml的植物乳杆菌AS1.555菌液和浓度为2.2×109-4.1×109cfuml的短双歧杆菌ATCC15701菌液，备用；S4、将枸杞、茶叶和甜菜根粉碎混合，混合后与短双歧杆菌ATCC15701菌液和去离子水按质量比3-5：0.2-0.7：5-10混合后装缸发酵，无氧发酵，温度为35-37℃，发酵时间为6-12小时；然后再加入和短双歧杆菌ATCC15701菌液质量相同的植物乳杆菌AS1.555菌液，进行有氧发酵，温度为35-37℃，发酵时间为6-12小时，发酵完成后加入3%过氧化氢对短双歧杆菌ATCC15701和植物乳杆菌AS1.555进行灭活，然后在8000rmin下离心10min，收集上清液，所得上清液送入蒸汽灭菌锅灭菌121℃灭菌15min，灭菌程序:10℃min，升至121℃，在121℃保持15min，程序结束后自然降温；S5、将步骤S2中制备的脂肪干细胞悬液，与含有体积分数为5%脐带血血浆的生理盐水混合定溶至浓度为5×105ml，分别取调整浓度后的脂肪干细胞溶液1ml，和脂肪干细胞溶液体积分数20-50%的步骤S4中制备的发酵上清液混合，置于安剖瓶中得到脂肪干细胞注射剂。

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