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申请/专利权人：新希望六和股份有限公司;山东新希望六和集团有限公司;北京维德维康生物技术有限公司

摘要：本发明提供了一种同时检测猪肉中磺胺、氟苯尼考、替米考星和甲氧苄啶的快速检测试剂盒，属于兽药残留分析和检测技术领域。本发明提供的试剂盒能够同时高效且准确的检测猪肉中是否含有磺胺类、氟苯尼考、替米考星、甲氧苄啶，并且有效地解决了ELISA反应时间较长以及胶体金灵敏度不高的问题。

主权项：1.一种同时检测猪肉中磺胺、氟苯尼考、替米考星和甲氧苄啶的快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下组分：反应液A、反应液B、阴性对照液、浓缩清洗剂、显色剂A、显色剂B、停止剂、预混孔板和反应孔板；所述反应液A为磺胺单克隆抗体、氟苯尼考单克隆抗体、替米考星单克隆抗体和甲氧苄啶单克隆抗体混合工作液；所述混合工作液由反应液A稀释液稀释得到；每1000ml所述反应液A稀释液的配方为：100ml0.5MEDTA、900ml0.02M硼酸盐缓冲液、0.05%环糊精、0.05%酪蛋白钠、0.10%TritonX-100、0.05%叠氮钠、0.10%海藻糖、0.05%聚乙二醇、0.05%聚丙烯酰胺和0.05%乳清蛋白；所述混合工作液中磺胺单克隆抗体、氟苯尼考单克隆抗体、替米考星单克隆抗体和甲氧苄啶单克隆抗体的稀释倍数为：磺胺啶单克隆抗体125W、氟苯尼考啶单克隆抗体18W、替米考星单克隆抗体16.8W和甲氧苄啶单克隆抗体130W；所述氟苯尼考单克隆抗体的抗原制备方法如下：A.半抗原合成（1）称取500mg氟苯尼考原药，加入6ml吡啶，搅拌至全部溶解，加入153mgHS，加热到60度，通过TLC发现反应没有变化时，旋干吡啶，用甲醇溶解，加入硅胶进行拌样，旋干样品进行柱层析，收集所需要的溶液，旋干，得450.2mg氟苯尼考半抗原；B.免疫原制备（1）将17.08mg氟苯尼考半抗原用1.5mlDMF溶解，加入25.75mgEDC，15.46mgNHS溶解，室温搅拌活化2-3h，得到氟苯尼考免疫原反应液；（2）称取50mgBSA溶于3.5ml0.1M碳酸氢钠溶液中充分溶解，冰浴降温至0-4℃搅拌，将氟苯尼考免疫原反应液逐滴加入，搅拌反应24h；（3）将步骤（2）反应产物装入透析袋，2L0.01MPBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到氟苯尼考免疫原；C.包被原制备（1）将17.08mg氟苯尼考半抗原用1.5mlDMF溶解，加入25.75mgEDC，15.46mgNHS溶解，室温搅拌活化2-3h，得到氟苯尼考包被原反应液；（2）称取33.6mgOVA溶于3.5ml0.1M碳酸氢钠溶液中，使其充分溶解，冰浴降温至0-4℃搅拌，将氟苯尼考包被原反应液逐滴加入，搅拌反应24h；（3）将步骤（2）反应产物装入透析袋，2L0.01MPBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到氟苯尼考包被原；所述氟苯尼考半抗原的结构式为： ；所述磺胺单克隆抗体的抗原制备方法如下：a.半抗原合成①称取500mg氢氧化钠，用6ml水在冰浴下溶解，称取600mg氨基苯甲酸，加入其中，搅拌，分批加入700mg乙酰苯胺磺酰氯，点板监测反应；②反应完后PH值调节为2，粘稠物析出后用乙醇溶解，70%的乙醇重结晶，冷却析晶过夜，过滤，得到580mg中间体；③用8ml甲醇溶解580mg中间体，加入5ml盐酸，点板监测反应，反应完全后，加入氢氧化钠溶液调节PH值为7，萃取，旋干收集到的溶液得到430mg磺胺半抗原；b.免疫原制备①将5.55mg磺胺半抗原用1.5mlDMF溶解，加入0.98mgHCl，4.5mgNaNO2溶解，室温搅拌活化2-3h，得到磺胺免疫原反应液；②称取20mgBTG溶于3.5ml0.1M碳酸氢钠溶液中充分溶解，冰浴降温至0-4℃，搅拌下，将磺胺免疫原反应液逐滴加入，搅拌反应24h；③将步骤②反应产物装入净透析袋,2L0.01MPBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到磺胺免疫原；c.包被原制备①将20.6mg磺胺半抗原用1.5mlDMF溶解，加入3.65mgHCl,16.8mgNaNO2溶解，室温搅拌活化2-3h，得到磺胺包被原反应液；②称取50mgOVA溶于3.5ml0.1M碳酸氢钠溶液中使其充分溶解，冰浴降温至0-4℃，搅拌下将磺胺包被原反应液逐滴加入，搅拌反应24h；③将步骤②反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋，2L0.01MPBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到磺胺包被原；所述磺胺半抗原的结构式为： ；所述甲氧苄啶单克隆抗体的抗原制备方法如下：（A）免疫原制备1）将5.19mg甲氧苄啶原料用1.5mlDMF溶解，加入10.3mgEDC,6.18mgNHS溶解，室温搅拌活化2-3h，得到甲氧苄啶免疫原反应液；2）称取20mgKLH溶于3.5ml0.1M碳酸氢钠溶液中，冰浴降温至0-4℃，搅拌下，将甲氧苄啶免疫原反应液逐滴加入，搅拌反应24h；3）将步骤2）反应产物装入透析袋，2L0.01MPBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到甲氧苄啶免疫原；（B）包被原制备1）将19.3mg甲氧苄啶原料用1.5mlDMF溶解，加入38.34mgEDC,23.02mgNHS溶解，室温搅拌活化2-3h，得到甲氧苄啶包被原反应液；2）称取50mgOVA溶于3.5ml0.1M碳酸氢钠溶液中，冰浴降温至0-4℃，搅拌下，将甲氧苄啶包被原反应液逐滴加入，搅拌反应24h；3）将反应产物装入透析袋，2L0.01MPBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到甲氧苄啶包被原；所述替米考星单克隆抗体的抗原制备方法如下：（a）免疫原制备I.将15.56mg替米考星原料用1.5mlDMF溶解，加入3.05mgCDI溶解，室温搅拌活化2-3h，得到替米考星免疫原反应液；Ⅱ.称取20mgKLH溶于3.5ml0.1M碳酸氢钠溶液中，冰浴降温至0-4℃，搅拌下将替米考星免疫原逐滴加入，搅拌反应24h；Ⅲ.将步骤Ⅱ反应产物装入透析袋，2L0.01MPBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到替米考星免疫原；（b）包被原制备I.将57.9mg替米考星原料用1.5mlDMF溶解，加入11.34mgCDI溶解，室温搅拌活化2-3h，得到替米考星包被原反应液；Ⅱ.称取50mgOVA溶于3.5ml0.1M碳酸氢钠溶液中，冰浴降温至0-4℃，搅拌下将替米考星包被原反应液逐滴加入，搅拌反应24h；Ⅲ.将步骤Ⅱ反应产物装入透析袋，2L0.01MPBS，4℃搅拌透析3d，将透析产物离心得到替米考星包被原；所述反应液B为用反应液B稀释液稀释酶标二抗所得到的酶标记物工作液；每1100ml所述反应液B稀释液的配方为：300ml胎牛血清、750ml0.02molL硼酸盐缓冲液、50ml异丙醇、5W诱惑红、0.10%叠氮钠、0.05%酪蛋白、0.05%海藻糖和0.05%蔗糖；所述阴性对照液为0.01molLpH7.4PBS缓冲液；所述浓缩清洗剂为含有2%吐温20和0.05%Proclin300的0.01molLpH7.4PBS缓冲液；所述显色剂A为含有0.1%过氧化脲、0.5%乙酸钠、0.5‰光稳定剂和0.2‰聚乙烯醇的混合水溶液；所述显色剂B为含有0.2%N,N二甲基甲酰胺、0.3%甲酸、0.5%四甲基联苯胺、0.5‰光稳定剂和0.1%环糊精的混合水溶液；所述停止剂为含有0.05%硫酸和0.2%十二烷基硫酸钠的混合水溶液；所述反应孔板的处理方式为：不同的反应孔板分别加入100μL的10μgmL的磺胺、氟苯尼考、替米考星和甲氧苄啶包被原，37℃温育2h，倾去包被液，用稀释20倍的洗涤液洗涤，干燥后每孔加入150μL封闭液，37℃温育1h，倾去孔内液体，干燥后获得包被有包被原的反应孔板，用铝膜真空密封保存；所述包被缓冲液为：0.03molLpH9.6的碳酸盐缓冲液；所述封闭液为：含有50gL蔗糖、2.5gL酪蛋白、0.5%小牛血清和3‰叠氮钠的0.2molLpH7.7磷酸盐缓冲溶液。

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