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申请/专利权人：天津大学

摘要：本发明公开了一种基于碳纳米管和单链DNA缠绕结构的DNA测序方法，其步骤为首先将碳纳米管与单链DNA混合形成一种复合结构，并将该复合结构置于含有Na+和Mg2+等溶液的反应槽中，通过电泳作用的驱动力使其穿过纳米孔测序器件，实现信号的捕获，进而确定缠绕在碳纳米管上的DNA序列。该复合结构穿孔所产生的信号大于单链DNA穿孔所产生的信号，更易读取，大幅提高了测序的效率和准确率。

主权项：1.一种基于碳纳米管和单链DNA缠绕结构的DNA测序系统，包括：反应槽，内部配置为装入导电盐溶液及碳纳米管和单链DNA的复合结构；纳米孔测序器件，包括单层或多层薄膜，以氮化硅基为靶材，通过磁控溅射技术在100nm的硅衬底上制备出厚度为30nm的氮化硅薄膜，通过聚焦离子束技术以硅薄膜为支撑结构在氮化硅薄膜上打出纳米孔，制备得到的薄膜具有至少一纳米孔，所述纳米孔测序器件中纳米孔的孔径为10纳米至20纳米，配置为插入导电盐溶液中；电导率测试仪，包含正负电极，其中正负电极配置为插入导电溶液中且分别位于支撑薄膜的两侧，该电导率测试仪配置为测量复合结构穿过纳米孔时电导率变化，所述复合结构穿过纳米孔测序器件的方式为电泳方式，所述电泳方式具体包括：将所述纳米孔测序器件插入导电性盐溶液中，且所述碳纳米管和单链DNA的复合结构也放于所述导电性盐溶液中；通过电极通电使溶液中导电性盐溶液发生流动，带动所述复合结构的流动穿过纳米孔，其中，所述测序系统基于碳纳米管和单链DNA缠绕结构的DNA测序方法包括：将待检测的单链DNA与碳纳米管混合形成碳纳米管缠绕DNA的一包一复合结构；使该复合结构穿过纳米孔测序器件的纳米孔，通过电导率测试仪测量穿过纳米孔时纳米孔测序器件两侧电导率的变化，根据该变化分析出穿过的碱基的种类和顺序，实现所述DNA的测序，所述碳纳米管和单链DNA复合结构通过如下制备方法得到：将待检测的单链DNA与碳纳米管按设定比例混合在导电性盐溶液中；将上述混合物置于离心管中，经涡旋振荡混匀；将离心管置于超声仪中，以设定功率在冰水浴中进行超声；以设定离心力对进行超声后的溶液进行离心；将进行离心后的混合物进行上清液稀释分离，其中分离后的上清液为所需的碳纳米管和单链DNA复合结构，下沉淀物为未与单链DNA结合的碳纳米管。

全文数据：基于碳纳米管和单链DNA缠绕结构的DNA测序方法技术领域本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种单链DNA碱基的种类和顺序的检测方法，还涉及基于碳纳米管和单链DNA复合结构的DNA测序系统，以及涉及基于碳纳米管和单链DNA复合结构的制备方法。背景技术基因测序技术是指通过分析特定DNA片段，确定碱基序列的一种技术。其在多物种基因测序，疾病筛查和诊断，个性化治疗，法医鉴定，生物信息读取等方面具有重要意义。DNA测序自第一代技术发展至今，测序成本不断降低，测序速度大幅提高，取得了一系列突破性地进展。新一代纳米孔测序技术通过检测单链DNA通过纳米孔时不同碱基所产生的电学信号而确定DNA序列，主要有电流式和电容式两种类型。目前纳米孔测序主要基于生物纳米孔和固态纳米孔，前者因其噪声小，且可通过自组装形成而首先被用于纳米孔测序，但无法避免生物分子对pH值和温度等环境变化敏感的缺陷。由此，稳定性好、持久性高且易商业化批量生产的固态纳米孔应运而生，然而由于电学信号过于微弱，易受环境干扰，常需辅以复杂的材料修饰技术降低噪声，还需要通过限制穿孔速率以提高分辨率，不仅牺牲了读取速率，还影响了检测准确率。因此，亟需开发一种新技术以实现快速准确的基因测序。发明内容一要解决的技术问题有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于碳纳米管和单链DNA缠绕的DNA测序方法、测序系统和制备方法，以至少部分克服现有技术中单链DNA分子穿孔产生的信号过于微小，不易读取，且易受噪声干扰；单链DNA分子为柔性结构，易折叠，检测准确率低的技术问题。二技术方案本发明公开了一种基于碳纳米管和单链DNA缠绕结构的DNA测序方法：将碳纳米管和单链DNA以设定的比例混合，形成一包一复合的缠绕形态，将其置于导电性盐溶液中，通过电极驱动使其穿过置于导电性盐溶液的纳米孔通道，利用离子阻塞效应可测得穿孔时所产生的电学响应，进而确定碱基的种类和排列顺序。三有益效果从上述技术方案可以看出，本发明基于碳纳米管和单链DNA缠绕结构的DNA测序方法或系统至少具有以下有益效果：1将特定管径和长度的碳纳米管与单链DNA在溶液状态下以设定的比例混合均匀，形成一包一复合的缠绕形态，可极大地避免单链DNA单独通过纳米孔时的自折叠现象，实现了单链DNA的测序；2将碳纳米管和单链DNA复合结构通过纳米孔，增强了穿孔信号的响应强度，大幅提高了测序的准确性；3通过碳纳米管和单链DNA的复合结构，增加了测试样品的尺度，实现了可使用较大固态纳米孔进行测序。附图说明图1是本发明实施例提出的基于碳纳米管和单链DNA复合结构的DNA纳米孔测序的实施步骤图。图2是本发明实施例提出的单层或者多层薄膜纳米孔测序器件的制作步骤图。图3是本发明实施例提出的碳纳米管和单链DNA一包一复合缠绕结构的示意图。图4是本发明实施例提出的一种基于碳纳米管和单链DNA复合结构的DNA纳米孔测序器件的示意图。图5是本发明实施例提出的一种基于碳纳米管和单链DNA复合结构的制备过程。【附图中元件符号说明】1-碳纳米管；2-单链DNA；3-碳纳米管和单链DNA的复合结构；4-纳米孔测序器件；5-反应槽；6-电极导线；7-电导率测试仪。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。本发明提供了一种基于碳纳米管和单链DNA缠绕的DNA测序技术，其中图1为本发明的实施步骤，如图1所示，步骤A中将待检测的单链DNA与碳纳米管在溶液状态下进行混合；步骤B中将已有的单层或者多层薄膜纳米孔测序器件置于导电性盐溶液中，导电性盐溶液可以是Na+和Mg2+的溶液；步骤C中电泳作用即通过电极通电使溶液中导电性盐发生流动，带动混合物的流动穿过纳米孔；步骤D中使用电导率测试仪测试纳米孔测序器件两端的电导率变化，从而推出所测单链DNA碱基的种类和顺序。图2为本发明提出的单层或者多层薄膜纳米孔测序器件的制作步骤，如图2所示，以氮化硅基为靶材，通过磁控溅射技术在100nm的硅衬底上制备出厚度约为30nm的氮化硅薄膜，然后通过刻蚀技术在硅薄膜上刻蚀出直径为数百纳米的空腔，最后通过聚焦离子束技术以硅薄膜为支撑结构在氮化硅薄膜上打出纳米孔，在本发明的一个实施例中，纳米孔的孔径为10nm。图3为本发明提出的碳纳米管1和单链DNA2一包一复合缠绕结构的示意图，该一包一复合的缠绕形态，可极大地避免单链DNA2单独通过纳米孔时的自折叠现象。图5为碳纳米管1和单链DNA2复合结构的制备步骤，如图5所示，首先配置设定浓度的导电性盐溶液，以该溶液为溶剂配置待测DNA2溶液，在本发明是一个实施例中，导电性盐溶液为NaCl溶液，浓度为0.1M，待测DNA2溶液浓度为10μM；取一定量上述溶液置于离心管中，并加入单壁碳纳米管1，经涡旋振荡混匀，在本发明的一个实施例中，DNA2溶液容量为2mL，碳纳米管1质量为2mg；将离心管置于超声仪，在冰水浴中进行超声设定时长，在本发明的一个实施例中，超声功率为100W，时长为1小时；将上述溶液继续在设定离心力中进行离心操作设定时长，在本发明的一个实施例中，离心力为12000g，时长为0.5小时；将上述处理过的混合物进行上清液分离，其中分离后的上清液为所需的碳纳米管1和单链DNA2复合结构，下沉淀物为未与单链DNA结合的碳纳米管。图4为是本发明提出的一种基于碳纳米管和单链DNA复合结构的DNA纳米孔测序器件的示意图，包括：碳纳米管和单链DNA复合结构3，纳米孔测序器件4，反应槽5内置导电性盐溶液，电极导线6，电导率测试仪7。将按前述方法制备的碳纳米管和单链DNA复合结构3置于反应槽5的导电性盐溶液中，电极6通电，使导电性盐溶液内的电离子发生运动，带动复合结构3运动并穿过纳米孔测序器4中的纳米孔，电导率测试仪7可以检测到纳米孔测序器件4两端相应的电导率变化，从而实现待测DNA的测序。以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

权利要求：1.一种基于碳纳米管和单链DNA缠绕结构的DNA测序方法，包括：将待检测的单链DNA与碳纳米管混合形成碳纳米管缠绕DNA的一包一复合结构；使该复合结构穿过纳米孔测序器件的纳米孔，通过电导率测试仪测量穿过纳米孔时纳米孔测序器件两侧电导率的变化，根据该变化分析出穿过的碱基的种类和顺序，实现所述DNA的测序。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述纳米孔测序器件为单层或者多层薄膜中贯穿纳米孔。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述混合包括：将待检测的单链DNA与碳纳米管以设定比例在溶液状态下混合。4.根据权利要求2所述的方法，其中，该复合结构穿过纳米孔测序器件的方式为电泳方式，电泳方式具体包括：将所述纳米孔测序器件插入导电性盐溶液中，且碳纳米管和单链DNA的复合结构也放于该导电性盐溶液中；通过电极通电使溶液中导电性盐发生流动，带动复合结构的流动穿过纳米孔。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述纳米孔测序器件中纳米孔的孔径为2纳米至20纳米。6.一种基于碳纳米管和单链DNA复合结构的DNA测序系统，其特征在于包括：反应槽，内部配置为装入导电盐溶液及碳纳米管和单链DNA的复合结构；纳米孔测序器件，包括单层或多层薄膜，具有至少一纳米孔，配置为插入导电盐溶液中；电导率测试仪，包含正负电极，其中正负电极配置为插入导电溶液中且分别位于支撑薄膜的两侧，该电导率测试仪配置为测量复合结构穿过纳米孔时电导率变化。7.一种基于碳纳米管和单链DNA复合结构的制备方法，包括：将待检测的单链DNA与碳纳米管按设定比例混合在导电性盐溶液中；将上述混合物置于离心管中，经涡旋振荡混匀；将离心管置于超声仪中，以设定功率在冰水浴中进行超声；以设定离心力对进行超声后的溶液进行离心；将进行离心后的混合物进行上清液稀释分离，其中分离后的上清液为所需的碳纳米管和单链DNA复合结构，下沉淀物为未与单链DNA结合的碳纳米管。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的导电性盐溶液是NaCl溶液。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述的冰水浴是指在超声仪的水里加冰或者冰袋保证加有碳纳米管和DNA混合溶液的离心管的温度。

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