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申请/专利权人：中国海洋大学

摘要：本发明公开了一种基于时间分辨荧光共振能量转移的蛋白‑小分子相互作用分析方法。本发明以PROTAC模拟靶蛋白HaloTag和E3泛素连接酶CDC20作为模式蛋白，通过构建Tb‑to‑Cy5FRET体系来分析蛋白受体和小分子配体的相互作用模式。运用多通道扫描测定供受体的荧光衰减曲线，并以供受体荧光强度的比值计算FRET比率，使用Prism8的单位点‑总结合拟合模型计算解离常数Kd；对供受体的荧光衰减曲线进行拟合，计算不同受体浓度下的结合参数、FRET效率、FRET距离等，进而分析其相互作用模式。该方法简单方便，为新型PROTAC靶标以及新型E3泛素连接酶与PROTAC之间的相互作用模式分析提供了一种新的通用方法。

主权项：1.一种基于时间分辨荧光共振能量转移的蛋白-小分子相互作用分析方法，其特征在于：所述分析方法具体包括以下步骤：（1）分别用FRET供受体荧光团对PROTAC模拟靶蛋白进行荧光标记，并进行蛋白纯化和光谱学性质表征；所述模拟靶蛋白为HaloTag及E3泛素连接酶CDC20；用FRET受体荧光团Cy5-NHSester标记PROTAC模拟靶蛋白HaloTag，FRET供体荧光团CoraFluor-1freeacidTb标记E3泛素连接酶CDC20蛋白；（2）将荧光标记的PROTAC模拟靶蛋白与其小分子配体的荧光衍生化试剂共孵育组成FRET体系；用荧光供体的激发波长激发，采集FRET体系中供受体的荧光衰减曲线，并对荧光衰减曲线进行拟合；（3）分析光谱数据，计算蛋白小分子相互作用的结合参数，得出蛋白-小分子相互作用模式分析结果；所述分析光谱数据为运用多通道扫描，通过测定FRET体系中供受体的荧光衰减曲线，统计供体和受体在一定的时间窗口内光子数的总和，以供受体荧光强度的比值计算FRET比率；使用Prism8中单位点-总结合拟合模型计算解离常数Kd；通过对供受体的荧光衰减曲线进行拟合，计算不同浓度的受体存在下FRET效率以及FRET距离的变化，分析蛋白-小分子相互作用模式；当存在不同浓度荧光标记的PROTAC模拟靶蛋白时，FRET距离和FRET效率不随模拟靶蛋白浓度的增加而发生显著改变，即FRET距离的变化在±5%以内，FRET效率的变化在±10%以内，此时FRET表现为FRET效率和FRET距离均不变的配体浓度依赖型静态FRET；当存在低浓度荧光标记的小分子时，FRET距离和FRET效率几乎保持不变，此时FRET体系表现为浓度依赖型静态FRET；随着小分子浓度的增加，FRET距离呈现显著的下降趋势，而FRET效率呈现显著的增长趋势，此时FRET体系表现为FRET距离和效率改变的距离依赖型动态FRET。

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百度查询： 中国海洋大学 一种基于时间分辨荧光共振能量转移的蛋白-小分子配体相互作用分析方法