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申请/专利权人：浙江大学医学院附属第一医院(浙江省第一医院)

摘要：本发明公开HBV特异性耗竭型CD8+T细胞小鼠模型的构建及其应用。首先采用HBV的HBsAg和HBcAg抗原肽免疫CD45.1型C57小鼠，以获得具有HBV特异性免疫的小鼠；将肝脏特异性表达HBV转基因的CD45.2型C57小鼠进行X射线清髓辐照；采集HBV特异性免疫的CD45.1型小鼠骨髓，眼眶静脉移植经清髓辐照的CD45.2型小鼠；移植后采用流式检测HBV特异性CD8+T细胞及耗竭相关表型，确认HBV特异性耗竭型T细胞小鼠模型的建立。本发明所述小鼠模型具有较高水平HBV特异性CD8+T细胞，并且其耗竭表型显著，可应用于乙肝T细胞耗竭的形成机制和相关诊治新靶点及新策略研究。

主权项：1.一种HBV特异性耗竭型CD8+T细胞小鼠模型的构建，其特征在于，通过以下方案实现：1建立具有HBV特异性免疫的小鼠，采用HBV的HBsAg和HbcAg抗原肽皮下注射CD45.1型C57小鼠，间隔28-30天后进行第2次免疫，第2次免疫28-30天后，分离该小鼠外周血单个核细胞，采用流式检测组合1进行HBV特异性CD8+T细胞的检测，经HbsAg和HbcAg抗原肽刺激后检测到IFN-γ的释放，表明2次免疫获得具有HBV特异性免疫的CD45.1型小鼠；2进行HBV肝脏特异性表达的CD45.2型转基因小鼠的清髓处理，准备5周龄左右的HBV肝脏特异性表达小鼠，于骨髓移植前一天经过X射线辐照仪照射进行清髓，剂量为4.5Gy，结束后饲养过夜；3进行骨髓移植以构建HBV特异性耗竭型CD8+T细胞小鼠模型，首先准备实验用粗纤维纸张、1.5ml离心管、底部开有小孔的200μl离心管，置于灭菌袋中120摄氏度灭菌30分钟后于烘箱内烘烤备用；配置细胞重选液和流式洗脱染色液，然后在移植当天无菌分离HBV抗原肽免疫过的CD45.1小鼠股骨和胫骨，暴露出骨腔，随后将暴露出骨腔的股骨和胫骨置于底部开有小孔的200μl离心管，然后再将200μl离心管放置于1.5ml离心管内，于4度4000g离心40秒，此时200μl离心管内的股骨和胫骨呈白色，骨腔内无红色骨髓，而1.5ml离心管底部有大量的红色细胞块，用红细胞裂解液去除红细胞，剩余细胞过70μM滤网，细胞计数后向经过辐照清髓的HBV肝脏特异性表达的CD45.2转基因鼠移植骨髓细胞1M；4采用流式检测评估HBV特异性耗竭型CD8+T细胞小鼠模型的相关免疫指标，每周采血通过流式观察移植入受体鼠的CD8+T细胞增殖分化情况，第28天分离肝脏浸润的T细胞，通过HBV多肽的体外刺激培养4-5小时，采用流式检测组合2结合APC-IFN-γ；进行检测，分析IFN-γ阳性细胞的Ly108-Tim3+阳性比例评估HBV特异性CD8+T细胞的耗竭程度，流式分析结果显示耗竭模型小鼠中CD8+；Ly108-；Tim3+T细胞亚群比例相较于对照组显著升高，表明模型构建成功。

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