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一种CIK细胞的培养方法及其应用专利

发布时间:2025-02-06 10:26:52 来源:龙图腾网 导航: 龙图腾网> 最新专利技术> 一种CIK细胞的培养方法及其应用

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申请/专利权人:潍坊吉涛医学科技有限公司;上海吉涛生物科技有限公司

申请日:2024-12-16

公开(公告)日:2025-01-21

公开(公告)号:CN119331817A

专利技术分类:....T细胞;NK细胞;T细胞或NK细胞的前体[2010.01]

专利摘要:本发明涉及细胞培养技术领域,具体涉及一种CIK细胞的培养方法及其应用。所述培养方法包括以下步骤:1分离外周血单个核细胞PBMC;2培养基A的制备;3培养基B的制备;4重悬并接种外周血单个核细胞;5细胞培养收集。本发明培养方法能够提高CIK细胞的得率,且其中CD3+CD56+双阳性细胞的比例较高,提高细胞增殖活性,促进CIK细胞增殖和杀伤活性的提高。

专利权项:1.一种CIK细胞的培养方法,其特征在于,包括以下步骤:1分离外周血单个核细胞:11抽取外周血,离心,得到上层血浆和下层血细胞沉淀,将上层血浆56℃水浴,4℃离心,取上清得到自体血浆;12将步骤11所得血细胞沉淀用生理盐水重悬混匀得到稀释血,缓慢加到淋巴细胞分离液上,离心;13步骤12离心结束后吸取中间白膜层,用生理盐水洗涤,弃上清,得外周血单个核细胞;2培养基A的制备:21将海藻糖、乙二酸酐溶于乙腈中,加入NaOH,搅拌,减压,在乙醇和乙醚混合溶液中重结晶,制得羧基化海藻糖;22将步骤21所得羧基化海藻糖分散于超纯水中,超声,搅拌,加入EDC和NHS,冰浴反应,加入纤连蛋白,冰浴反应,移出冰浴,25℃反应,透析,冷冻干燥,得到改性纤连蛋白;23向RPMI-1640培养基中加入步骤22所得改性纤连蛋白、IL-2、IL-12、IFN-γ、CD3单抗,得到培养基A;3培养基B的制备:31将菊芋洗净后烘干,粉碎过筛得到菊芋粉,与去离子水混合均匀,加入L-缬氨酸硝酸盐,混匀,升高水温至50℃,保温,过滤得滤液;32将蒲公英、金盏花、马齿苋和白芍洗净后烘干,粉碎过筛,得到中药粉末,与步骤31所得滤液混合均匀,灭菌,得到发酵底物;33将活化的天蓝色链霉菌接种到步骤32所述发酵底物中摇床培养,离心,上清液过滤,冷冻干燥,得到发酵制剂;34向RPMI-1640培养基中加入谷氨酰胺、GM-CSF、葡萄糖以及步骤33所述发酵制剂,得到培养基B;4重悬并接种外周血单个核细胞:41向培养基A中加入步骤11所得自体血浆,过滤除菌;42用步骤41中加入自体血浆的培养基A重悬步骤13所得外周血单个核细胞,接种至培养瓶中,接种密度为1×106cellsmL,将接种时间作为培养第0d,置于5%CO2、37℃条件下培养;5细胞培养收集:51将培养基B过0.22μm滤膜过滤除菌,步骤42培养72h后,补加培养基B至细胞密度为1×106cellsmL;52步骤51继续培养,每2d补加一次培养基B,维持细胞密度为1×106cellsmL,细胞培养13d后收集细胞。

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