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申请/专利权人：信雅生物科技（苏州）有限公司

摘要：本发明提供了一种新型人转录因子——锌指BED型包涵子1在临床肺癌中表达情况及该基因在肺癌中的作用，涉及分子生物学领域及肿瘤学领域。锌指BED型包涵子1zinc finger,BED‑type containing 1的国际命名为ZBED1，基因ID号为9198。基于该基因序列所研制的siRNA可能对肺癌的靶向治疗具有十分重要的应用价值。利用小干扰RNA阻断肺癌细胞中ZBED1蛋白表达，可以抑制肺癌细胞的增殖、克隆形成能力及细胞周期进展。本发明公开了能特异性阻断ZBED1基因的小干扰RNA的制备方法，以及该小干扰RNA对肺癌细胞的作用。

主权项：1.一种能够特异性抑制ZBED1基因的s i RNA的构建方法，其特征在于：针对人ZBED1基因的编码区，设计2个能特异性敲减人ZBED1基因的靶序列：RNAi‑1‑F：GGAAGUACAUCUCUACCAA；RNAi‑1‑R：CCUUCAUGUAGAGAUGGUUdTdT；RNAi‑2‑F：GCAAACUGGUGGAGUACUU；RNAi‑2‑R：CGUUUGACCACCUCAUGAAdTdT。

全文数据：一种能够特异性抑制ZBED1基因的siRNA的构建方法及其应用技术领域[0001]本发明属于分子生物学及肿瘤学领域，具体的涉及到一种能够特异性抑制ZBEDl基因的siRNA的构建方法及其应用。背景技术[0002]锌指BED型包涵子Izincfinger，BED_typecontainingl，ZBED1又名DNA复制相关元素结合因子，属于锌指蛋白ZBED家族，由694个氨基酸残基组成，分子量约78kDa，其编码蛋白被认为是一种调控DNA复制、染色质结构重塑、蛋白质合成、细胞周期等的关键转录因子。令人感兴趣的是，ZBEDl在肿瘤中的研究至今未见报道。前期工作发现采用免疫组化检测ZBEDl在人肺癌组织高表达，并且与肿瘤T分期显著相关。由此提示，ZBEDl是人肺癌特异高表达基因，可能在肺癌生长中发挥重要作用。发明内容[0003]本发明的目的在于针对ZBEDl基因的研究现状，阐明其在肺癌中的表达情况，提出能够特异性抑制ZBEDl基因的siRNA的构建方法及其应用。[0004]本发明的目的通过以下技术方案实现。[0005]1.检测ZBEDl蛋白在临床肺癌中的表达情况，包括以下步骤：[0006]1临床肺癌组织标本的收集及标本信息：收集2009年1月至2016年6月于云南省肿瘤医院胸外科行肺原发肿瘤根治性切除术的122例I一ΙΠΑ期肺腺癌患者的癌组织和癌旁肺组织标本。其中，男性63例，女性59例;患者平均年龄54.4岁，年龄范围27至78岁；[0007]2苏木素一伊红HE染色进行病理诊断；[0008]3免疫组化检测ZBEDl蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达情况；[0009]⑷统计分析ZBEDl蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达差异；[0010]2.—种能够特异性抑制ZBEDl基因的siRNA的构建方法，包括以下步骤：[0011]1利用NCBIhttps:www.ncbi·nlm.nih·govgene数据库，获得人ZBEDl基因的转录本及编码CDS区信息转录本1:匪_00117113603区：1283-2367，具体序列见序列表；[0012]2根据siRNA序列设计原则，针对人ZBEDl基因的编码区，设计2个能特异性敲减人ZEBDl基因的靶序列；[0014]3化学合成该靶序列；[0015]3.验证2中SiRNA抑制效率的方法，其特征在于直接利用Westernblot检测ZBEDl蛋白的表达，内参蛋白为GAPDH;[0016]4.检测ZBEDl基因对肺癌细胞生物学功能的影响及具体方法，包括：[0017]1细胞增殖活性检测MTS法）：将IO3个生长状态良好细胞接种于96孔板，每孔加入150ul完全培养基，置于5%C0237°C培养箱中培养1天后，每孔加MTS溶液5mgml30ul，继续孵育2小时;选择490nm波长测定各孔的吸光度，连续检测5天；[0018]2流式细胞周期检测:将处于对数生长期的2XIO6个细胞于70%的乙醇中固定、漂洗，离心收集细胞，0.2M柠檬酸柠檬酸钠高渗处理30分钟，IXI3BS洗2次，0.1%TritonPBS配制洗1次，再用500ygmlPI和0.1%RNAaseA，室温避光孵育30分钟，流式细胞仪检测分析。[0019]本发明的有益效果：[0020]1.本发明公开了ZBEDl蛋白在临床肺癌组织中高表达。[0021]2.用本发明研制的siRNA能特异性抑制肺癌细胞系中内源性ZBEDl的表达。[0022]3.MTS法检测细胞增殖表明，与转染对照RNA相比，转染本发明研制的两个siRNA能抑制肺癌细胞的增殖能力，说明ZBED1基因能促进肺癌细胞的增殖。[0023]4.流式细胞术检测肺癌细胞周期表明，与转染对照RNA相比，转染本发明研制的两个siRNA能抑制肺癌细胞的细胞周期进程，使其阻滞于Gl期，说明ZBEDl基因能促进肺癌细胞周期从G1期向S期转化。[0024]5.功能学结果提示，本发明研制的siRNA可能对肺癌的靶向治疗具有十分重要的应用价值。附图说明[0025]图1为ZBEDl蛋白在临床肺癌组织中高表达；[0026]图2为两种siRNA能特异性抑制肺癌细胞系中内源性ZBEDl的表达；[0027]图3为两种siRNA对肺癌细胞增殖能力的抑制情况；[0028]图4为两种siRNA对肺癌细胞细胞周期的阻滞情况；[0029]图5为2个能特异性敲减人ZBEDl基因的靶序列。[0030]如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。具体实施方式[0031]1.检测ZBEDl蛋白在临床肺癌中的表达情况，包括以下步骤：[0032]1临床肺癌组织标本的收集及标本信息：收集2009年1月至2016年6月于云南省肿瘤医院胸外科行肺原发肿瘤根治性切除术的122例I一ΙΠΑ期肺腺癌患者的癌组织和癌旁肺组织标本。其中，男性63例，女性59例;患者平均年龄54.4岁，年龄范围27至78岁；[0033]2苏木素一伊红HE染色进行病理诊断；[0034]3免疫组化检测ZBEDl蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达情况；[0035]⑷统计分析ZBEDl蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达差异；[0036]如图1所示，为ZBEDl蛋白在临床肺癌癌组织和癌旁组织中的表达情况，从图1可以看出，ZBEDl在70.50%肺癌组织中表达，在46.70%癌旁组织中表达，说明ZBEDl蛋白在肺癌组织中的表达较癌旁高。[0037]2.研制能特异性抑制ZBEDl基因的siRNA，包括以下步骤：[0038]1利用NCBIhttps:www.ncbi·nlm.nih·govgene数据库，获得人ZBEDl基因的转录本转录本I:NM_〇〇1171136.1及编码CDS区信息具体序列见序列表）；[0039]转录本Ivariantl，mRNA:[0040]CGCGGGCGGCGCGGAAGCGGCGGCGGCGCGGCCGGGGCAGCCATGTCGCCATTGTCTGCGGCGCGGGCGGCCCTGCGGGTCTACGCGGTAGGCGCCGCGGTGATCCTGGCGCAGCTGCTGCGGCGCTGCCGCGGGGGCTTCCTGGAGCCAGCAGGTCCCCACGCATGAGCAGCCGTCCAGCAGGCAGGCTCCGGTGGAGAAGCAATGGAGAATAAAAGCCTGGAGAGCTCCCAGACAGACCTGAAGCTGGTGGCCCACCCCCGCGCCAAGAGCAAGGTGTGGAAGTATTTCGGCTTCGACACCAACGCCGAGGGATGCATCCTGCAGTGGAAGAAAATCTACTGCCGCATCTGCATGGCCCAGATCGCCTACTCCGGAAACACCTCCAACCTGTCCTACCACCTGGAGAAGAACCACCCCGAGGAATTCTGCGAGTTCGTCAAGAGCAACACGGAGCAGATGCGTGAAGCCTTCGCCACCGCCTTCTCCAAGCTGAAGCCCGAGTCGTCCCAGCAGCCCGGGCAGGACGCGCTGGCCGTCAAGGCCGGCCACGGCTACGACAGCAAGAAGCAGCAGGAGCTGACGGCCGCCGTGCTGGGCCTCATCTGCGAGGGGCTGTACCCAGCCTCCATCGTGGACGAGCCCACCTTCAAGGTGCTGCTGAAGACGGCCGACCCCCGGTATGAGCTGCCCAGCCGGAAGTACATCTCTACCAAGGCCATCCCTGAGAAGTACGGGGCCGTCCGGGAGGTGATCCTGAAGGAGCTGGCCGAGGCCACCTGGTGTGGCATCTCCACCGACATGTGGAGGAGTGAGAATCAGAACCGCGCCTACGTCACGCTGGCCGCCCACTTCCTGGGCCTGGGCGCCCCCAACTGCCTGTCCATGGGCTCCCGCTGCCTGAAGACCTTCGAGGTGCCCGAAGAGAACACGGCGGAGACCATCACGCGAGTGCTCTATGAGGTCTTCATCGAGTGGGGCATCAGCGCCAAGGTCTTCGGGGCCACCACCAACTATGGCAAGGACATCGTGAAGGCGTGCTCCCTGCTGGACGTCGCAGTGCACATGCCCTGCCTGGGCCACACCTTCAATGCCGGCATCCAGCAGGCCTTCCAGCTCCCGAAGCTGGGGGCGCTGCTGTCGCGCTGCCGCAAACTGGTGGAGTACTTCCAGCAGTCTGCCGTGGCCATGTACATGCTCTATGAGAAGCAGAAGCAGCAGAACGTGGCCCACTGCATGCTGGTGAGCAACCGCGTCTCCTGGTGGGGGAGCACGCTGGCCATGCTGCAGCGCCTCAAGGAGCAGCAGTTCGTCATCGCCGGGGTCTTGGTGGAGGACAGCAACAACCACCACCTCATGCTGGAGGCCAGCGAGTGGGCCACCATCGAGGGGCTGGTGGAGCTCCTGCAGCCCTTCAAGCAGGTGGCCGAGATGCTGTCGGCCTCCAGGTACCCCACCATCAGCATGGTGAAGCCGCTGCTGCACATGCTCCTGAACACCACGCTCAACATCAAGGAGACCGACTCCAAGGAGCTCAGCATGGCCAAGGAGGTCATCGCCAAGGAGCTTTCCAAGACCTACCAGGAGACGCCCGAGATCGACATGTTTCTCAACGTGGCCACCTTCCTGGACCCCCGCTACAAGAGGCTGCCCTTCCTCTCCGCCTTCGAGCGGCAGCAGGTGGAGAATCGCGTGGTGGAAGAGGCCAAGGGCCTGCTGGACAAGGTCAAAGACGGCGGCTACCGGCCGGCTGAGGACAAGATCTTCCCGGTGCCCGAGGAGCCTCCCGTCAAGAAGCTCATGCGGACATCCACGCCGCCGCCCGCCAGCGTCATCAACAACATGCTGGCCGAGATCTTCTGCCAGACAGGCGGCGTGGAGGACCAGGAAGAGTGGCATGCCCAGGTGGTGGAGGAGCTGAGCAACTTCAAGTCCCAGAAGGTGCTTGGCCTCAACGAAGACCCCCTCAAGTGGTGGTCAGACCGCCTGGCCCTCTTCCCCCTGCTGCCCAAGGTGCTGCAGAAGTACTGGTGCGTGACGGCCACGCGCGTCGCCCCTGAGCGTCTCTTCGGATCCGCCGCCAACGTGGTCAGCGCCAAGAGGAACCGGCTGGCTCCCGCGCACGTGGACGAGCAGGTGTTTCTGTATGAGAACGCCCGGAGTGGGGCAGAGGCGGAACCCGAGGACCAGGACGAGGGGGAGTGGGGCCTGGACCAGGAGCAGGTGTTCTCCTTGGGGGATGGCGTCAGCGGCGGTTTCTTTGGCATTAGGGACAGCAGCTTCCTGTAGCGAGGAAGCGTGTTGTCTTACAAGTCATCCCCGCAGCAGCCCATTGGATGCTTTGCTGTAAATACTTACCCGGTCAGCTTGGTTTTGAACCTCAGAGACCATCCACTGTCTTTGACACCTAGAAGGTGGAAAAAGGAAAGAGATTTGAGAAGTGAGAGAGGGTCGGGGGCGGTGGCTCCTGTCTATAATCGCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGTGGGCAGATCAGCTGAGGTCAGGAGATCGAGACCAGCCTGGCCAACATGGCGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCAGGACTGATGGCATGTGCCTGTAATCCCAGCTTCTGGAGGCTGAGGCCAGAGAATCGCTTGAACCTGGGAGGTGGAGGTTGCAGTAAGCTGAGATCGCTGCACTCCAGCCTGGGCGACAAGAGCGAGACTCTCTCAAAAAGAAAAAAGAAGACACAAGAGAGGTGGCTTTGAGTGGGTTTCCTTTCCTCCCCTATTCCCGGGGCCCGGACGACTTCTGCTTGGGAACTGCCAACGCTTCTGCTTGGGAATTGCGTGCAGCAGAGCCTAGAGGAGCTGTTCCTTCCTTCACAGATACTTAAGACCTCCACCATGTCTGATTCGAGTTCTCCCTGGGAGGGTTTAGAAGAAACGCAGGAACATTCTGGGTGGCGTCGAAGGAGCCTTTCCCGATCATCATGTGTGACTTCTGCGAGGTCCAGATCACTGAATTCATGTTTACATTCTCGTGCAAGCAGGGACCTCTTGCTTCTGAGAAATGGGGAAGAGACCTTTTAGCCAAAATGCCCTTCTTAAAAAGAGAGACCTTTTTTTTTAATGTTCGGTTAAAAATGTGACAGATGAGTACAAAAATGCAGACACTTAACAAAAAGCAAACAGAAAAAAAAGTGTGGAATGTGTTGTATTTTCGACAGGTTGCTGCCAGAGAGCCTGCTTCCTGCTGCCTGCCGAAATTTCACTTTGCGGAGTTGGTCCTTAAAACTGGGCGGTGGCCGGGCGTGGTGGCTCACGCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACCAACATGGTGAAACCTCGTGTCTACTAAAAATACAAGAAACTAGCCAGATGCGGTGGCACCCGCCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCGGAAGATTCGCTTGAGCCCAGGAGGTGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGACTACGCCACTGCACTCCAGCCTGGAGGCCAGAGTGAGACTCCGTCTCAAAACAAAACAAAAGTGGGTGGCTCACGGGTCCGGAGGTTATGTCTTCGGTGTCTCAGCCCTAAAAGTCCAGTTCCCCCGTGCGGCCAGCTTTTCCACATAAGGTGTTTTTGATTTGATTACCGGAAAGGACTCTTGATTCTTCTCTTTTAAACTGAATACCATAGGGGAAATGAATTTTAAAATATTGCCCCCGGAGGGGTTTTCCGTGGCTGGATTCCTGCGAGTTGCTTTCAGTCATTCAGGGAAACAGAAAGACGTTTTCCAACATGTAGAACTGCTTTTTAACTGGAGGAAAAATACTTCAGGAGGCTTAGCATATTGCTTGGATTCTACGTGCAGCGGGTTCTCTGCCTCCGTGAAGACAAGCTGGGCTGGGGAGAACGGTGTCTAGGAGGGATGACCCCACTCAGCTCCAGGCAGTGTTCTGCCGAGACCCCAAGAACTCGGGGTGTCAGAGGGCAAAGGAACTACCTGCCTTTCACGGCTGCTGACTTCTCAGGGCTGCAAGCAGCACAGAATGTTATCCTTACGTCCTGAGCCGGTTTAAGTCTGTGGAAAAGGAAGCACGGGAGAAATCCACGTAACCTTTGCTTTCTTTTTAAGGGAAGCGGTTCCGCCGTGAACTTGGAACCCTCAGCTCCGGGTGTTCTCGGCAGAAGGGCAGCTGGAAGGGACACAGTGGGGCAGGCTTTGGGGTTGCTCCCTGTTCTGCCCCGAGGCCGGGGACGCAGGGCAGCCCACGCCTCCGTGGGCTCCATTCTGTAGCATTGCCAGCGTTCTCTTCACGTCTCTAACAATCCTTCGCTTTTCCTCACTCACGTGGAAATGTGAACTGTCCCGGCTCTGTCTTCATTTTTATTTTTAAGCCATCGTTCCCCTCCTGAACGGTTGCCCCTTATTTAATGCTGTAAAGTTGGACTGTTGTTCAATAAACCAGAGCAATGCATTAGCTCCTCATTCATTTGTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA[0041]CDS区（XY染色体：2488635-2490719:[0042]ATGGAGAATAAAAGCCTGGAGAGCTCCCAGACAGACCTGAAGCTGGTGGCCCACCCCCGCGCCAAGAGCAAGGTGTGGAAGTATTTCGGCTTCGACACCAACGCCGAGGGATGCATCCTGCAGTGGAAGAAAATCTACTGCCGCATCTGCATGGCCCAGATCGCCTACTCCGGAAACACCTCCAACCTGTCCTACCACCTGGAGAAGAACCACCCCGAGGAATTCTGCGAGTTCGTCAAGAGCAACACGGAGCAGATGCGTGAAGCCTTCGCCACCGCCTTCTCCAAGCTGAAGCCCGAGTCGTCCCAGCAGCCCGGGCAGGACGCGCTGGCCGTCAAGGCCGGCCACGGCTACGACAGCAAGAAGCAGCAGGAGCTGACGGCCGCCGTGCTGGGCCTCATCTGCGAGGGGCTGTACCCAGCCTCCATCGTGGACGAGCCCACCTTCAAGGTGCTGCTGAAGACGGCCGACCCCCGGTATGAGCTGCCCAGCCGGAAGTACATCTCTACCAAGGCCATCCCTGAGAAGTACGGGGCCGTCCGGGAGGTGATCCTGAAGGAGCTGGCCGAGGCCACCTGGTGTGGCATCTCCACCGACATGTGGAGGAGTGAGAATCAGAACCGCGCCTACGTCACGCTGGCCGCCCACTTCCTGGGCCTGGGCGCCCCCAACTGCCTGTCCATGGGCTCCCGCTGCCTGAAGACCTTCGAGGTGCCCGAAGAGAACACGGCGGAGACCATCACGCGAGTGCTCTATGAGGTCTTCATCGAGTGGGGCATCAGCGCCAAGGTCTTCGGGGCCACCACCAACTATGGCAAGGACATCGTGAAGGCGTGCTCCCTGCTGGACGTCGCAGTGCACATGCCCTGCCTGGGCCACACCTTCAATGCCGGCATCCAGCAGGCCTTCCAGCTCCCGAAGCTGGGGGCGCTGCTGTCGCGCTGCCGCAAACTGGTGGAGTACTTCCAGCAGTCTGCCGTGGCCATGTACATGCTCTATGAGAAGCAGAAGCAGCAGAACGTGGCCCACTGCATGCTGGTGAGCAACCGCGTCTCCTGGTGGGGGAGCACGCTGGCCATGCTGCAGCGCCTCAAGGAGCAGCAGTTCGTCATCGCCGGGGTCTTGGTGGAGGACAGCAACAACCACCACCTCATGCTGGAGGCCAGCGAGTGGGCCACCATCGAGGGGCTGGTGGAGCTCCTGCAGCCCTTCAAGCAGGTGGCCGAGATGCTGTCGGCCTCCAGGTACCCCACCATCAGCATGGTGAAGCCGCTGCTGCACATGCTCCTGAACACCACGCTCAACATCAAGGAGACCGACTCCAAGGAGCTCAGCATGGCCAAGGAGGTCATCGCCAAGGAGCTTTCCAAGACCTACCAGGAGACGCCCGAGATCGACATGTTTCTCAACGTGGCCACCTTCCTGGACCCCCGCTACAAGAGGCTGCCCTTCCTCTCCGCCTTCGAGCGGCAGCAGGTGGAGAATCGCGTGGTGGAAGAGGCCAAGGGCCTGCTGGACAAGGTCAAAGACGGCGGCTACCGGCCGGCTGAGGACAAGATCTTCCCGGTGCCCGAGGAGCCTCCCGTCAAGAAGCTCATGCGGACATCCACGCCGCCGCCCGCCAGCGTCATCAACAACATGCTGGCCGAGATCTTCTGCCAGACAGGCGGCGTGGAGGACCAGGAAGAGTGGCATGCCCAGGTGGTGGAGGAGCTGAGCAACTTCAAGTCCCAGAAGGTGCTTGGCCTCAACGAAGACCCCCTCAAGTGGTGGTCAGACCGCCTGGCCCTCTTCCCCCTGCTGCCCAAGGTGCTGCAGAAGTACTGGTGCGTGACGGCCACGCGCGTCGCCCCTGAGCGTCTCTTCGGATCCGCCGCCAACGTGGTCAGCGCCAAGAGGAACCGGCTGGCTCCCGCGCACGTGGACGAGCAGGTGTTTCTGTATGAGAACGCCCGGAGTGGGGCAGAGGCGGAACCCGAGGACCAGGACGAGGGGGAGTGGGGCCTGGACCAGGAGCAGGTGTTCTCCTTGGGGGATGGCGTCAGCGGCGGTTTCTTTGGCATTAGGGACAGCAGCTTCCTGTAGATGGAGAATAAAAGCCTGGAGAGCTCCCAGACAGACCTGAAGCTGGTGGCCCACCCCCGCGCCAAGAGCAAGGTGTGGAAGTATTTCGGCTTCGACACCAACGCCGAGGGATGCATCCTGCAGTGGAAGAAAATCTACTGCCGCATCTGCATGGCCCAGATCGCCTACTCCGGAAACACCTCCAACCTGTCCTACCACCTGGAGAAGAACCACCCCGAGGAATTCTGCGAGTTCGTCAAGAGCAACACGGAGCAGATGCGTGAAGCCTTCGCCACCGCCTTCTCCAAGCTGAAGCCCGAGTCGTCCCAGCAGCCCGGGCAGGACGCGCTGGCCGTCAAGGCCGGCCACGGCTACGACAGCAAGAAGCAGCAGGAGCTGACGGCCGCCGTGCTGGGCCTCATCTGCGAGGGGCTGTACCCAGCCTCCATCGTGGACGAGCCCACCTTCAAGGTGCTGCTGAAGACGGCCGACCCCCGGTATGAGCTGCCCAGCCGGAAGTACATCTCTACCAAGGCCATCCCTGAGAAGTACGGGGCCGTCCGGGAGGTGATCCTGAAGGAGCTGGCCGAGGCCACCTGGTGTGGCATCTCCACCGACATGTGGAGGAGTGAGAATCAGAACCGCGCCTACGTCACGCTGGCCGCCCACTTCCTGGGCCTGGGCGCCCCCAACTGCCTGTCCATGGGCTCCCGCTGCCTGAAGACCTTCGAGGTGCCCGAAGAGAACACGGCGGAGACCATCACGCGAGTGCTCTATGAGGTCTTCATCGAGTGGGGCATCAGCGCCAAGGTCTTCGGGGCCACCACCAACTATGGCAAGGACATCGTGAAGGCGTGCTCCCTGCTGGACGTCGCAGTGCACATGCCCTGCCTGGGCCACACCTTCAATGCCGGCATCCAGCAGGCCTTCCAGCTCCCGAAGCTGGGGGCGCTGCTGTCGCGCTGCCGCAAACTGGTGGAGTACTTCCAGCAGTCTGCCGTGGCCATGTACATGCTCTATGAGAAGCAGAAGCAGCAGAACGTGGCCCACTGCATGCTGGTGAGCAACCGCGTCTCCTGGTGGGGGAGCACGCTGGCCATGCTGCAGCGCCTCAAGGAGCAGCAGTTCGTCATCGCCGGGGTCTTGGTGGAGGACAGCAACAACCACCACCTCATGCTGGAGGCCAGCGAGTGGGCCACCATCGAGGGGCTGGTGGAGCTCCTGCAGCCCTTCAAGCAGGTGGCCGAGATGCTGTCGGCCTCCAGGTACCCCACCATCAGCATGGTGAAGCCGCTGCTGCACATGCTCCTGAACACCACGCTCAACATCAAGGAGACCGACTCCAAGGAGCTCAGCATGGCCAAGGAGGTCATCGCCAAGGAGCTTTCCAAGACCTACCAGGAGACGCCCGAGATCGACATGTTTCTCAACGTGGCCACCTTCCTGGACCCCCGCTACAAGAGGCTGCCCTTCCTCTCCGCCTTCGAGCGGCAGCAGGTGGAGAATCGCGTGGTGGAAGAGGCCAAGGGCCTGCTGGACAAGGTCAAAGACGGCGGCTACCGGCCGGCTGAGGACAAGATCTTCCCGGTGCCCGAGGAGCCTCCCGTCAAGAAGCTCATGCGGACATCCACGCCGCCGCCCGCCAGCGTCATCAACAACATGCTGGCCGAGATCTTCTGCCAGACAGGCGGCGTGGAGGACCAGGAAGAGTGGCATGCCCAGGTGGTGGAGGAGCTGAGCAACTTCAAGTCCCAGAAGGTGCTTGGCCTCAACGAAGACCCCCTCAAGTGGTGGTCAGACCGCCTGGCCCTCTTCCCCCTGCTGCCCAAGGTGCTGCAGAAGTACTGGTGCGTGACGGCCACGCGCGTCGCCCCTGAGCGTCTCTTCGGATCCGCCGCCAACGTGGTCAGCGCCAAGAGGAACCGGCTGGCTCCCGCGCACGTGGACGAGCAGGTGTTTCTGTATGAGAACGCCCGGAGTGGGGCAGAGGCGGAACCCGAGGACCAGGACGAGGGGGAGTGGGGCCTGGACCAGGAGCAGGTGTTCTCCTTGGGGGATGGCGTCAGCGGCGGTTTCTTTGGCATTAGGGACAGCAGCTTCCTGTAG[0043]2根据siRNA序列设计原则，针对人ZBEDl基因的编码区，设计2个能特异性敲减人ZBEDl基因的靶序列；[0045]~~3化学合成该靶序列;[0046]3.验证2中siRNA抑制效率的方法，其特征在于直接利用Westernblot检测ZBEDl蛋白的表达，内参蛋白为GAPDH;[0047]如图2所示，为Westernblot验证siRNA对A549肺癌细胞中ZEBDl的抑制情况，从图2可以看出，与阴性对照组siRNA比较，本发明设计的2个siRNA能使A549肺癌细胞中ZBEDl蛋白表达降低，说明本发明设计的2个靶序列能明显抑制人ZBEDl基因的表达，可用于后续研究。[0048]4.检测ZBEDl基因对肺癌细胞生物学功能的影响及具体方法，包括：[0049]1细胞增殖活性检测MTS法）：将IO3个生长状态良好细胞接种于96孔板，每孔加入150ul培养基，置于5%⑶237°C培养箱中培养1天后，每孔加MTS溶液5mgml30ul，继续孵育2小时;选择490nm波长测定各孔的吸光度，连续检测4天；[0050]如图3所示，为用SiRNA干扰人ZBEDl基因后肺癌细胞增殖能力的变化。从图3可以看出，与阴性对照组细胞比较，干扰ZBEDl基因后，A549肺癌细胞增殖能力明显减慢，说明本发明设计的两个siRNA，抑制ZBEDl基因后，均能抑制肺癌细胞的增殖能力。[0051]⑵流式细胞周期检测:将处于对数生长期的2XIO6个细胞于70%的乙醇中固定、漂洗，离心收集细胞，0.2M柠檬酸柠檬酸钠高渗处理30分钟，IXI3BS洗2次，0.1%TritonPBS配制洗1次，再用500ygmlPI和0.1%RNAaseA，室温避光孵育30分钟，流式细胞仪检测分析。[0052]如图4所示，为干扰人ZBEDl基因后肺癌细胞周期的变化。从图4可以看出，与阴性对照组细胞比较，干扰ZBED1基因后，A549肺癌细胞处于G1期细胞比例增加，说明本发明设计的两个siRNA，抑制ZEBDl基因后，均能使肺癌细胞的细胞周期阻滞于Gl期。[0053]由此可见，能够特异性抑制ZBEDl基因的siRNA在抑制肺癌细胞增殖和制备治疗肿瘤药物方面具有良好的应用。[0054]以上所述实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

权利要求：1.一种能够特异性抑制ZBEDl基因的SiRNA的构建方法，其特征在于:针对人ZBEDl基因的编码区，设计2个能特异性敲减人ZBEDl基因的靶序列：RNAH-F:GGAA⑶ACAUCUCUACCAA;RNAi-l-R：CCUUCAUGUAGAGAUGGUUdTdT；RNAi-2-F：GCAAACUGGUGGAGUACUU；RNAi-2-R:CGUUUGACCACCUCAUGAAdTdT〇2.根据权利要求1的方法制备的抑制ZBED1基因表达的siRNA。3.根据权利要求2所述的抑制ZBED1基因表达的siRNA编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主囷。4.如权利要求2所述的抑制ZBEDl基因表达的siRNA在抑制肺癌细胞增殖中的应用。5.如权利要求2所述的抑制ZBEDl基因表达的siRNA在制备治疗肿瘤药物中的应用。

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