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申请/专利权人：云南师范大学

摘要：本发明提供了一种中缅树鼩组织DNA的提取方法，包括以下步骤：a将中缅树鼩组织在匀浆液中离；b将步骤a获得的上清液离心；c将步骤c获得的沉淀在匀浆液中离心；d将步骤c获得的沉淀与第一溶液混合均匀，再与第二溶液混合后冰溶；e将步骤d获得的溶液以第三溶液混合，冰溶；f将步骤e获得的溶液离心；g将步骤f获得的上清液在混合溶液中抽提，重复一次；h将步骤g获得的上清液与无水乙醇混合，放置过夜；i将步骤h获得的溶液离心，用乙醇洗涤干燥。本发明通过限定提取过程中试剂种类、试剂用量以及提取条件，提取得到的DNA纯度较高，电泳条带无拖尾现象，且成本较低。

主权项：一种中缅树鼩组织DNA的提取方法，包括以下步骤：a将中缅树鼩组织在匀浆液中在3～5℃、1200rmin～1800rmin条件下离心8min～12min，所述中缅树鼩组织与匀浆液的质量体积比为0.15～0.25g：0.5～1.5mL；b将步骤a获得的上清液在3～5℃、1200rmin～1800rmin条件下离心18min～22min；c将步骤c获得的沉淀在匀浆液中在3～5℃、1200rmin～1800rmin条件下离心8min～12min，所述匀浆液与中缅树鼩组织的体积质量比为1.5～2.5mL：0.15～0.25g；d将步骤c获得的沉淀与第一溶液混合均匀，再与第二溶液混合后冰溶8min～12min；所述第一溶液包括Tris‑HCl、Na2EDTA和NaCl；所述第二溶液包括NaOH和十二烷基硫酸钠；所述第一溶液、第二溶液和中缅树鼩组织的体积质量比为40～60μL：90～110μL：0.15～0.25g；e将步骤d获得的溶液与第三溶液混合，冰溶50min～70min；所述第三溶液包括钾离子和醋酸离子；所述第三溶液与第二溶液的体积比为70～80:90～110；f将步骤e获得的溶液在11000rmin～13000rmin条件下离心8min～12min；g将步骤f获得的上清液在混合溶液中在11000rmin～13000rmin条件下抽提2～3min，重复一次；所述混合溶液包括酚、氯仿和异戊醇；所述上清液与所述混合溶液的体积比为0.8～1.2:0.8～1.2；h将步骤g获得的上清液与3℃～5℃的无水乙醇混合，在‑35℃～‑45℃放置过夜；i将步骤h获得的溶液在3℃～5℃、11000rmin～13000rmin下离心15min～30min，用3℃～5℃乙醇洗涤干燥；其中，所述第二溶液包括：1wt％的十二烷基硫酸钠和0.2mmolL NaOH。

全文数据：一种中缅树齣组织DNA的提取方法技术领域[0001]本发明属于DNA提取技术领域，尤其涉及一种中缅树駒组织DNA的提取方法。背景技术[0002]中缅树駒是一类小型的攀援型哺乳动物，形似松鼠，在种系上较小鼠、大鼠等常用啮齿类实验动物更接近人类，并且能够罹患许多与人相似的疾病，是目前除黑猩猩、长臂猿夕卜，唯一能够感染人类乙肝病毒的动物，受到了生物学与医学工作者的高度关注。[0003]对中緬树駒进行研宄时，提取其组织DNA是必不可少的步骤之一。现有技术公开了诸多其他动物DNA的提取方法，但这些方法均不适用于中緬树_组织NDA的提取，提取得到的DNA纯度较低，DNA的电泳条带拖尾现象严重。发明内容[0004]本发明的目的在于提供一种中緬树駒组织DNA的提取方法，本发明提供的提取方法提取得到中緬树駒的DNA纯度较高，电泳条带无拖尾现象。[0005]本发明提供了一种中緬树駒组织DNA的提取方法，包括以下步骤：[0006]a将中缅树駒组织在匀浆液中在3〜5°C、1200rmin〜1800rmin条件下离心8min〜12min，所述中緬树調组织与匀楽;液的质量体积比为0.15〜0.25g:0.5〜1.5mL;[0007]b将步骤a获得的上清液在3〜5°C、l2〇Ormin〜1800rmin条件下离心18min〜22min；[0008]C将步骤C获得的沉淀在匀衆液中在3〜5°C、1200rmin〜1800rmin条件下离心8min〜12min，所述匀浆液与中緬树駒组织的体积质量比为1.5〜2.5mL:0.15〜0.25g;[0009]d将步骤c获得的沉淀与第一溶液混合均匀，再与第二溶液混合后冰溶8min〜12min;所述第一溶液包括Tris-HCl、NasEDTA和NaCl;所述第二溶液包括NaOH和十二烷基硫酸钠;所述第一溶液、第二溶液和中缅树駒组织的体积质量比为40〜60uL:90〜11OuL:0.15〜0.25g；[0010]e将步骤d获得的溶液以第三溶液混合，冰溶50min〜7〇min;所述第三溶液包括钾离子和醋酸离子;所述第三溶液与第二溶液的体积比为70〜80:90〜丨10;[0011]f将步骤e获得的溶液在ll〇〇〇rmin〜13〇〇〇rmin条件下离心8min〜I2min;[0012]g将步骤f获得的上清液在混合溶液中在ll〇〇〇rmin〜i3〇〇〇rtnin条件下抽提2〜3min，重复一次;所述混合溶液包括酚、氯仿和异戊醇;所述上清液与所述混合溶液的体积比为〇_8〜1.2:0.8〜1.2;[0013]h将步骤g获得的上清液与3°C〜5°C的无水乙醇混合，在-35°C〜-45。：放置过夜；[0014]i将步骤h获得的溶液在3°C〜5°C、11000rmin〜13000rmin下离心15min〜30min，用3°C〜5°C乙醇洗涤干燥。[0015]本发明首先将中缅树駒的组织在匀浆液中进行离心提取线粒体Dna，中緬树駒组织与匀浆液的质量体积比优选为〇_2g:lmL，所述离心的条件优选为4°C、1500rtnin，离心时间优选为lOmin。所述匀浆液中包括蔗糖、似疋0了六、1^8-11：1、0：12，优选包括0_25111〇1几蔗糖、10mmolLNa2EDTA、30mmolLTris-HCl和2_5mmolLCaCh。所述匀浆液的pH值优选为8.2。[0016]经过第一次离心获得上清液后，继续在3〜5°C、1200rmin〜l8〇Ormin条件下离心18min〜22min。第二次离心的条件优选为4°C、1500rmin离心20min。[0017]第二次离心完毕后，弃上清液后得到的沉淀在匀浆液中在3〜5°C、1200rrain〜1800rmin条件下离心8min〜12min。第三次离心的条件优选为4°C、1500rmin离心lOmin。第三次离心使用的匀浆液与第一次离心上使用的匀浆液相同，包括蔗糖、Na2EDTA、Tris-HC1、CaCl2，优选包括0•25molL蔗糖、10mmolLNa2EDTA、30mmolLTris-HCl和2•5mmolLCaCl2。所述匀浆液的pH值优选为8.2。第三次离心使用的匀浆液与中緬树駒组织的体积质量比为1.5〜2.5mL:0.15〜0.25g，优选为2mL:0.2g。[0018]第三次离心完毕后，将得到的沉淀与第一溶液混合均匀，再与第二溶液混合后冰溶8min〜12min。其中，所述第一溶液包括Tris-HCl、Na2EDTA和NaC1，优选包括1Ommo1LTris-HCl、10mni〇lLNasEDTA和0•15mmolLNaCl;所述第一溶液的pH值为8_0。将第三次离心完毕后得到的沉淀与第一溶液混合后轻轻吹打混合均匀，然后与第二溶液混合后冰溶8min〜12min，优选冰溶lOmin。所述第二溶液包括NaOH和十二烷基硫酸钠，优选包括lwt%的十二烷基硫酸钠和〇.2mmolLNaOH。所述第一溶液、第二溶液和中緬树駒组织的体积质量比为40〜60yL:90〜11OyL:0•15〜0•25g，更优选为50uL:1OOuL:0•2g。[0019]然后再将得到的溶液与第三溶液混合，冰溶50min〜70min，优选60min。所述第三溶液包括钾离子和醋酸离子，其中，钾离子浓度优选为3molL，所述醋酸根离子浓度优选为5molL。第三溶液和第二溶液的体积比为7〇〜80:90〜110,优选为75:100。[0020]将获得的溶液在11000rmin〜13000rmin条件下离心8min〜12min，第四次离心的条件优选为12000rmin，离心1Omin。[0021]将第四次离心获得的上清液在混合溶液中在nooorminwUOOOrmin条件下抽提2〜3min，重复一次，抽提条件优选为12〇〇〇rmin。其中，所述混合溶液为酚氯仿，包括酚、氯仿和异戊醇，酚、氯仿和异戊醇的体积比为24:24:1。所述上清液和混合溶液的体积比为0.8〜1.2:0.8〜1.2,优选为1:1。[0022]将抽提后获得的上清液与3t:〜5r：的无水乙醇混合，在_35r〜_45〇C下放置过夜。其中，无水乙醇优选为4°C，放置过夜的温度优选为-40°C。[0023]在冷冻过夜的溶液在3°C〜5°C、11000rmin〜13000rmin下离心15min〜30min，用4°C乙醇洗涤千燥，g卩可提取得到DNA。其中，第五次离心的条件优选为4°C、12000rmin。所述乙醇优选为75%的乙醇。[0024]本发明提供的提取方法的一个典型实施例如下：[0025]a将中緬树駒组织在匀浆液中4。：、15〇Ormin条件下离心丨0min，所述中緬树駒组织与匀浆液的质量体积比为0.2g:lmL;[0026]b将步骤a获得的上清液在代、l5〇Ormin条件下离心20min;_7]c将步骤c获得的沉淀在匀浆液中在4〇c、15〇〇rmin条件下离心1〇min，所述匀浆液与中緬树駒组织的体积质量比为2mL:0.2g;[0028]d将步骤C获得的沉淀与第一溶液混合均匀，再与第二溶液混合后冰溶10min;所述第一溶液包括Tris-HC1、Na2EDTA和NaCl;所述第二溶液包括NaOH和十二烷基硫酸钠;所述第一溶液、第二溶液和中緬树駒组织的体积质量比为50yL:100yL:0.2g;[0029]e将步骤d获得的溶液与第三溶液混合，冰溶60min;所述第三溶液包括钾离子和醋酸根离子;所述第三溶液与第二溶液的体积比为75:100;[0030]f将步骤e获得的溶液在12000rmin条件下离心lOmin;[0031]g将步骤f获得的上清液在混合溶液中在12000rmin条件下抽提2〜3min，重复一次;所述混合溶液包括酚、氯仿和异戊醇;所述上清液与混合溶液的体积比为1:1;[0032]h将步骤g获得的上清液与4°C的无水乙醇混合，在-40°C放置过夜；[0033]i将步骤h获得的溶液在4。：、12000rmin下离心15min〜30min，用4°C乙醇洗涤干燥。[0034]本发明通过限定提取过程中试剂种类、试剂用量以及提取条件，提取得到的DNA纯度较高，电泳条带无拖尾现象，且成本较低。附图说明[0035]图1为本发明实施例提取得到的DNA的电泳图，其中，1和2分别为实施例1和实施例2得到的DNA的电泳条带，3为比较例1得到的DNA的电泳条带。具体实施方式[0036]下面将结合本发明实施例中的附表，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0037]实施例1[0038]a将0_2g中緬树駒组织在lmL勾浆液中4°C、1500rmin条件下离心lOmin;所述匀楽液包括〇.25molL蔗糖、10mm〇lLNa2EDTA、30ramolLTris-HC1和2.5mmolLCaCh;[OO39]b将步骤a获得的上清液在4°C、1500rmin条件下离心20min;[0040]c将步骤c获得的沉淀在2mL匀浆液中在4°C、1500rmin条件下离心lOmin，所述匀浆液包括〇_25molL蔗糖、10mm〇lLNa2EDTA、30mmolLTris-HCl和2.5mmolLCaCl2;[0041]d将步骤c获得的沉淀与5〇此第一溶液混合均匀，再与1〇〇此第二溶液混合后冰溶1〇1^11;所述第一溶液包括1〇111111。111']^8-11：1、1〇111111。1凡似2£014和0.15111111。1凡似：1，pH值为8.0;所述第二溶液包括lwt%的十二烷基硫酸钠SDS和0.2mmolLNaOH;[0042]e将步骤d获得的溶液与75uL第三溶液混合，冰溶6〇min;所述第三溶液包括钾离子和醋酸根离子，其中，钾离子浓度优选为3molL，所述醋酸根离子浓度优选为5molL;[0043]f将步骤e获得的溶液在12000rmin条件下离心l〇min;[OO44]g将步骤f获得的上清液在等体积混合溶液中在12000rmin条件下抽提2min，重复一次;所述混合溶液包括体积比为24:24:1的酚、氯仿和异戊醇；[0045]h将步骤g获得的上清液与4°C的无水乙醇混合，在-4TC放置过夜；[0046]i将步骤h获得的溶液在4°C、12000rmin下离心30min，用4°C75%的乙醇洗漆干爍。[0047]实施例2[0048]a将〇.2g中緬树齣组织在lmL勾浆液中4-C、15〇〇rmin条件下离心1〇min;所述匀楽液包括〇_25molL蔗糖、10mm〇lLNa2EDTA、30_olLTris-HCl和2_5mmolLCaCl2;[0049]b将步骤a获得的上清液在代、1500rmin条件下离心20min;[0050]c将步骤c获得的沉丨疋在2mL勾菜液中在4°C、1500rmin条件下离心lOmin，所述匀浆液包括〇.25molL蔗糖、10mm〇lLNa2EDTA、30mmolLTris-HCl和2.5mmolLCaCl2;[0051]d将步骤c获得的沉淀与50uL第一溶液混合均匀，再与lOOyL第二溶液混合后冰溶lOmin;所述第一溶液包括l〇mmolLTris-HCl、10mmolLNa2EDTA和0.15mmolLNaCl，pH值为8•0;所述第二溶液包括lwt%的十二烷基硫酸钠SDS和0.2mmolLNaOH;[0052]e将步骤d获得的溶液与75此第三溶液混合，冰溶60min;所述第三溶液包括钾离子和醋酸根离子，其中，钾离子浓度优选为3molL，所述醋酸根离子浓度优选为5molL;[0053]f将步骤e获得的溶液在12000rmin条件下离心lOmin;[OO54]g将步骤f获得的上清液在等体积混合溶液中在12000rmin条件下抽提3min，重复一次;所述混合溶液包括体积比为24:24:1的酚、氯仿和异戊醇；[0055]h将步骤g获得的上清液与4°C的无水乙醇混合，在-4TC放置过夜；[0056]i将步骤h获得的溶液在4°C、12000rmin下离心15min，用4°C75%的乙醇洗涤干燥。[0057]比较例1[0058]将实施例1、实施例2和比较例1获得的DNA进行电泳，结果参见图1，图1为本发明实施例提取得到的DNA的电泳图，其中，1和2分别为实施例1和实施例2得到的DNA的电泳条带，3为比较例1得到的DNA的电泳条带。由图1可知，本发明提供的方法获得的电泳条带无拖尾，纯度高。[0059]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.一种中缅树駒组织DNA的提取方法，包括以下步骤：a将中缅树_组织在勾楽液中在3〜5°C、1200rmin〜1800rmin条件下离心8min〜lanin，所述中缅树駒组织与匀浆液的质量体积比为〇.15〜〇.25g:0.5〜1.5mL;b将步骤a获得的上清液在3〜5°C、1200rmin〜1800rmin条件下离心18min〜22min；C将步骤C获得的沉淀在匀浆液中在3〜5°C、1200rmin〜1800rmin条件下离心8min〜12min，所述匀浆液与中緬树駒组织的体积质量比为1.5〜2.5mL:0.15〜0.25g;d将步骤c获得的沉淀与第一溶液混合均勾，再与第二溶液混合后冰溶8min〜I2min;所述第一溶液包括Tris-HC1、NasEDTA和NaCl;所述第二溶液包括NaOH和十二烷基硫酸钠；所述第一溶液、第一•洛液和中细树购组织的体积质量比为40〜60yL:90〜110uL:0.15〜〇.25g；e将步骤d获得的溶液与第三溶液混合，冰溶5〇min〜7〇min;所述第三溶液包括钾离子和醋酸离子;所述第三溶液与第二溶液的体积比为70〜80:90〜110;f将步骤e获得的溶液在ll〇〇〇rmin〜13000rmin条件下离心8min〜12min;g将步骤f获得的上清液在混合溶液中在ll〇〇〇rmin〜13000rmin条件下抽提2〜3min，重复一次;所述混合溶液包括酚、氯仿和异戊醇;所述上清液与所述混合溶液的体积比为0.8〜1.2:0.8〜1.2;h将步骤g获得的上清液与3°C〜5°C的无水乙醇混合，在-35°C〜-45°C放置过夜；i将步骤h获得的溶液在3°C〜5°C、11000rmin〜13000rmin下离心15min〜30min，用:rc〜5°c乙醇洗涤干燥；其中，所述第二溶液包括:lwt%的十二烷基硫酸钠和〇.2mmolLNaOH。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，包括：a将中缅树駒组织在匀浆液中4°C、1500rmin条件下离心10min，所述中緬树駒组织与勾菜液的质量体积比为0.2g:lmL;b将步骤a获得的上清液在4°C、1500rmin条件下离心20min;c将步骤c获得的沉淀在匀浆液中在4°C、1500rmin条件下离心10min，所述匀浆液与中麵树詢组织的体积质量比为2mL:0.2g;d将步骤c获得的沉淀与第一溶液混合均勾，再与第二溶液混合后冰溶lOmin;所述第一溶液包括Tris-HCl、Na2EDTA和NaCl;所述第二溶液包括NaOH和十二烷基硫酸钠;所述第一溶液、第二溶液和中缅树駒组织的体积质量比为50yL:100iiL:0.2g;e将步骤d获得的溶液与第三溶液混合，冰溶60min;所述第三溶液包括钾离子和醋酸根离子;所述第三溶液与第二溶液的体积比为75:100;f将步骤e获得的溶液在12000rmin条件下离心lOmin;g将步骤f获得的上清液在混合溶液中在12000rmin条件下抽提2〜3min，重复一次；所述混合溶液包括酚、氯仿和异戊醇;所述上清液与混合溶液的体积比为1:1;h将步骤g获得的上清液与4°C的无水乙醇混合，在-40°C放置过夜；i将步骤h获得的溶液在4°C、12000rmin下离心15min〜30min，用4°C乙醇洗涤干燥。3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述匀浆液包括:〇.25molL蔗糖、10mmolLNa2EDTA、30mmolLTris-Hcl、2.5mmolLCaCl2。4.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述第一溶液包括：i〇mm〇lLTris-HCl、10mmolLNa2EDTA和0.15mmolLNaCl。5.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述第三溶液中，钾离子浓度为3rao1L，所述醋酸根离子浓度为5mo1L。6.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述混合溶液中，酚、氯仿和异戊醇的体积比为24:24:1。7.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述步骤i中，所述乙醇为75%乙醇。

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