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申请/专利权人：浙江大学;浙江全植生物科技有限公司

摘要：本发明公开了植物乳杆菌Lactobacillus plantarumZJUF T34及其应用，属于生物技术领域。所述植物乳杆菌ZJUF T34分离自传统发酵剂酸面团，该植物乳杆菌的保藏号为：CCTCC NO:M 2017399。本发明提供的植物乳杆菌ZJUF T34在胃肠道环境中具有很高的生存率、较强的胃肠粘附力，能显著抑制胃肠道致病菌的繁殖，尤其是金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌；植物乳杆菌ZJUF T34具有耐受高含量胆盐的能力，有利于其在肠道中存活和繁殖；植物乳杆菌ZJUF T34能够显著提高小鼠粪便中的含水量，具有缓解便秘的潜力；此外，植物乳杆菌ZJUF T34具有发酵乳和发酵豆乳的作用。

主权项：1.植物乳杆菌Lactobacillus plantarumZJUF T34，该植物乳杆菌的保藏号为：CCTCC NO:M 2017399。

全文数据：植物乳杆菌ZJUFT34及其应用技术领域本发明涉及生物技术领域，具体涉及植物乳杆菌LactobacillusplantarumZJUFT34及其应用。背景技术植物乳杆菌是广泛存在于发酵食品中，是一种常见的益生菌菌种。益生菌需要顺利通过胃的酸性环境以及十二指肠高胆盐环境，以活菌的状态到达小肠和大肠，并发挥其调节肠道菌群的作用Hood&Zottola,1988。而益生菌发挥其调节肠道菌群的作用，主要表现在能降低微环境的pH值，能黏附在肠道粘膜上与致病菌竞争黏附位点、与其凝集使致病菌顺便排除体外，还能一定程度上抑制致病菌的生长Gerritsenetal.,2011。为达到上述效果，植物乳杆菌需具有良好的耐酸、耐胆盐的能力，还要具备凝集黏附、抑制致病菌生长的功能。如申请公布号为CN102031229A的专利文献公开了一种分离自水果的植物乳杆菌LactobacillusplantarumBB9，该BB9乳酸菌株可表现高度的BSH活性，体外试验证实该菌株有良好的耐酸性及耐胆盐性，此外对肠道细胞的吸附能力也相当强。又如申请公布号为CN102533618A的专利文献公开了一种来源于发酵奶酒的植物乳杆菌LactobacillusplantarumCCFM8724，该植物乳杆菌CCFM8724具有体外抑制空肠弯曲杆菌生长的能力，耐酸性在pH2.0时存活良好与耐胆盐性能良好能耐受的胆盐水平达0.3％，对肠道上皮细胞具有良好的粘附能力，能抑制空肠弯曲杆菌粘附于肠道上皮细胞，抑制空肠弯曲杆菌在鸡肉中生长。便秘是一类由大肠运动异常导致的复杂病症，主要表现为排便困难、便量减少、直肠膨胀或排空时间延长Lembo&Camilleri,2003。申请公布号为CN107099492A的专利文献公开了一种从青海玉树藏族自治州的牦牛酸乳中分离到的植物乳杆菌LactobacillusplantarumYS4，能够抑制便秘造成的小鼠体重下降，粪便重量、颗粒数和含水量下降，能够用于制备预防便秘的食品。发明内容本发明的目的在于提供一株植物乳杆菌LactobacillusplantarumZJUFT34，该植物乳杆菌具有优异的益生作用，能够显著提高小鼠粪便含水量，具有缓解便秘的潜力；另外，该植物乳杆菌具有发酵乳、发酵豆乳的能力。本发明从北方做馒头用的传统发酵剂酸面团中分离筛选到一菌株T34，经理化性质分析及16SrRNA基因比对，鉴定该菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌ZJUFT34LactobacillusplantarumZJUFT34。植物乳杆菌ZJUFT34的16SrRNA的碱基序列如SEQIDNO.1所示。将植物乳杆菌ZJUFT34于2017年6月29日保藏于中国典型培养物保藏中心地址：中国武汉，武汉大学，保藏号为：CCTCCNO:M2017399。体外实验证明，植物乳杆菌ZJUFT34具有耐受胃肠道转运液的能力，能够耐受pH2.5、3.0、4.0的胃液，胃液耐受3h后转运到肠液中，活菌数几乎没有下降；同时具有耐受高含量胆盐的能力，在胆盐质量百分比含量为0.3-1.4％的环境中生长较好，胆盐含量为1.6％和1.8％时仍有生长，有利于其在肠道中生存和繁殖。植物乳杆菌ZJUFT34自凝率达到87.09％，具有较强的黏附胃肠道的能力；与致病菌的交互凝集率较高，尤其是与金黄色葡萄球菌的交互凝集率达到44.67％，植物乳杆菌ZJUFT34与致病菌凝集，并顺利排出体外，有利于肠道健康。植物乳杆菌ZJUFT34能够显著抑制胃肠道致病菌的繁殖，如鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌。因此，植物乳杆菌ZJUFT34可用于预防或治疗胃肠道菌群失衡。本发明的另一个目的是提供植物乳杆菌ZJUFT34在制备抑制胃肠道致病菌的药物或食品中的应用。作为优选，所述胃肠道致病菌为金黄色葡萄球菌或鼠伤寒沙门氏菌。本发明的另一个目的是提供植物乳杆菌ZJUFT34在制备预防或治疗便秘的药物或食品中的应用。本发明研究表明，植物乳杆菌ZJUFT34能够显著提高小鼠粪便中的含水量，乳杆菌产生的胞外多糖，可作为一种膨胀剂或者润滑剂，增加粪便中的含水量，而粪便含水量的增加有利于缓解便秘。作为优选，所述药物由植物乳杆菌ZJUFT34菌剂与在药学上可接受的载体组成。所述植物乳杆菌ZJUFT34菌剂为将含有所述植物乳杆菌ZJUFT34的菌液通过冷冻干燥制得的粉剂，其中含有＞1011CFUg的活性植物乳杆菌ZJUFT34。作为优选，所述药物的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。本发明的另一个目的是提供植物乳杆菌ZJUFT34在生产发酵乳制品中的应用。所述植物乳杆菌ZJUFT34具有发酵乳的潜力，作为发酵剂添加到脱脂乳中，24h发酵过程中，可以降低pH值到4.3，增加TTA值到105；显著增加了发酵乳中蛋白水解程度，丝氨酸含量可达到24mgmL；发酵过程和4℃保存中保持较高活菌率。通过发酵乳的质构分析，植物乳杆菌ZJUFT34发酵乳具有一定的持水能力，锁水能力好，有利于获得较高产量的发酵乳制品。优选地，植物乳杆菌ZJUFT34按照1.5-2×107cfumL添加到经灭菌处理的脱脂乳培养基脱脂乳11.5％，葡萄糖0.75％，蔗糖5％wv中，37℃条件下发酵24h。本发明的另一个目的是提供植物乳杆菌ZJUFT34在生产发酵豆乳制品中的应用。所述植物乳杆菌ZJUFT34具有发酵豆乳的潜力，作为发酵剂添加到豆乳中，发酵12h时，pH从7.71降低到4.09左右，随后12h降到3.58；增加TTA值到100。优选地，植物乳杆菌ZJUFT34按照1.5-2×107cfumL添加到经灭菌处理的豆乳培养基豆乳11.5％，葡萄糖0.75％，蔗糖5％wv中，37℃条件下发酵24h。本发明具备的有益效果：本发明提供的植物乳杆菌ZJUFT34在胃肠道环境中具有很高的生存率、较强的胃肠粘附力，能显著抑制胃肠道致病菌的繁殖，尤其是金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌；植物乳杆菌ZJUFT34具有耐受高含量胆盐的能力，有利于其在肠道中存活和繁殖；植物乳杆菌ZJUFT34能够显著提高小鼠粪便中的含水量，具有缓解便秘的潜力；此外，植物乳杆菌ZJUFT34具有发酵乳和发酵豆乳的作用。附图说明图1为LactobacillusplantarumZJUFT34在模拟人工胃液中的耐受。图2为LactobacillusplantarumZJUFT34在模拟人工胃肠液转运中的耐受。图3为LactobacillusplantarumZJUFT34自凝集特性。图4为LactobacillusplantarumZJUFT34发酵乳24小时内pH变化。图5为LactobacillusplantarumZJUFT34发酵乳4℃放置2周内pH变化。图6为LactobacillusplantarumZJUFT34发酵乳24小时内TTA变化。图7为LactobacillusplantarumZJUFT34发酵乳4℃放置2周内TTA变化。图8为LactobacillusplantarumZJUFT34发酵乳24小时内丝氨酸浓度变化情况。图9为LactobacillusplantarumZJUFT34发酵乳4℃放置2周内丝氨酸浓度变化情况。图10为LactobacillusplantarumZJUFT34发酵豆乳24小时内pH变化。图11为LactobacillusplantarumZJUFT34发酵豆乳24小时内TTA变化。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例11、菌株的筛选及分离材料：酸面团，北方做馒头用的传统发酵剂，本发明采用来自山东的样品。称取5g酸面团加入到45mL0.85％的灭菌生理盐水中，振荡制成悬液，进行系列梯度稀释，稀释后取10-5、10-6、10-7三个梯度涂布于MRS培养基上，每个梯度做三个平行。将涂布后的平板放入37℃厌氧培养箱中培养24-48h。挑选差异明显的菌落进行MRS培养基上划线分离，将平板放入37℃厌氧培养箱中培养24-48h。连续划线3-5次后，取一滴现配的5％的过氧化氢滴于载玻片上，挑取固体培养基上单菌落接入5％的过氧化氢液滴中并混匀，产生气泡为过氧化氢酶试验阳性，未产生气泡为过氧化氢酶试验阴性，过氧化氢酶试验阴性菌株为疑似益生菌株。将筛选得到的疑似益生菌株分别以1％接种量接入MRS-THIO液体培养基MRS中添加0.2％的巯基乙酸钠和含0.3％wv的猪胆盐的MRS-THIO培养基中上述处理放置在37℃厌氧培养箱中培养24h，取样在620nm下测定吸光值，计算24h的OD值差值，检测菌株的生长能力。将上述筛选得到的疑似益生菌株以1％接种量接种到pH3.0的MRS培养基中，37℃厌氧培养箱中培养24h，取样在600nm下测定吸光值，计算24h的OD值差值，检测菌株的生长能力，筛选得到了T34。2、菌株的鉴定将T34进行革兰氏染色，并进行了16SrRNA基因菌种鉴定，此鉴定送样上海派森诺生物有限公司进行，经过16SrRNA基因比对，T34为一株植物乳杆菌，命名为LactobacillusplantarumZJUFT34。将植物乳杆菌ZJUFT34于2017年6月29日保藏于中国典型培养物保藏中心地址：中国武汉，武汉大学，保藏号为：CCTCCNO:M2017399。3、最高胆盐浓度耐受性实验配制含不同胆盐浓度0.3％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％的MRS液体培养基，以不加胆盐的培养基作为对照，按1％的接种量接入培养基中，37℃厌氧培养24h，在0h和24h时测定620nm下测定吸光值，计算差值。培养基调整pH值为7.0。OD值差值0说明在此胆盐浓度下LactobacillusplantarumZJUFT34可以生长，如下表1所示，在0.3-1.8％的胆盐浓度下，LactobacillusplantarumZJUFT34均可以生长，说明其可以耐受0.3-1.8％的胆盐。表1LactobacillusplantarumZJUFT34对不同胆盐耐受情况与未添加胆盐的培养基比较，0.3％和0.4％的胆盐中T34的生长状况相当于普通培养基的80％以上，而0.6％-1.6％的胆盐中，T34的生长状况为普通培养基的50％以上，仅有1.8％的胆盐含量的培养基中，T34的生长仅为普通培养基的21％。说明此LactobacillusplantarumZJUFT34能在含有较高胆盐浓度的环境中生长，具体生长情况与胆盐浓度有关，具有较好的耐受性。4、模拟人工胃肠液耐受性人工胃液：NaCl0.2g100mL，胃蛋白酶pepsin0.35g100mL，用1molLHCl调整pH为2.0，2.5，3.0，4.0，过滤除菌备用0.22um膜。人工肠液：NaHCO31.1g100mL，NaCl0.2g100mL，胰蛋白酶trypsin0.1g100mL，猪胆盐1.8g100mL，调整pH值为8.0，过滤除菌备用。取0.5mL的供试菌液加入到4.5mL的人工胃液中，震荡10s后放入37℃厌氧培养，在处理0h、1h、2h、3h取样，测活菌数totalviablecounts。取0.5mL的上述3h人工胃液反应液加入到4.5mL的人工肠液中，震荡10s后放入37℃厌氧培养，在处理0h、3h、8h、24h取样，测活菌数totalviablecounts。N0：处理前的活菌数；N1：用PBS或人工胃肠液处理过的活菌数。如图1和图2所示，LactobacillusplantarumZJUFT34可耐受pH4.0和3.0胃肠液转运，实验结束时存活率高于90％；对pH2.5的胃肠液转运有一定的耐受性，胃液处理3h后，存活率为85.58％，肠液处理24h后存活率为72.57％；对pH2.0的胃肠液转运，在胃液处理3h后存活率已降低至35.86％，肠液处理8h能保持存活率几乎不变，处理24h后已检测不到活菌。说明菌株T34可耐受pH4.0、3.0和2.5的胃肠液转运，并且在肠液中的耐受性更高。5、黏附能力测定凝集特性取108cfumL的菌悬液4ml加入无菌离心管中，在0h、2h、4h、6h、8h、10h、18h、20h、22h、24h静置状态下取上层清液150uL加入到96孔板中，测定OD600nm值。A0：0h时样品的OD值；At：不同时间段样品的OD值。相同体积500uL的植物乳杆菌和病原菌混合，放置在室温下勿摇动，在0h、2h、4h、6h、8h、10h、18h、20h、22h、24h静置状态下取上层清液150uL加入到96孔板中，测定OD600nm值。Apat：病原菌0h时OD值；Aprobio：植物乳杆菌0h时OD值；Amix：病原菌和植物乳杆菌混匀4h的OD值。如图3所示，植物乳杆菌ZJUFT34的自凝集率8h时已达到50％，18h后超过85％，说明此植物乳杆菌ZJUFT34的自凝集作用较好，具有较好的肠道黏附的潜力。表2LactobacillusplantarumZJUFT34与不同病原菌交互凝集率如表2所示，与肠道致病菌之间的交互凝集作用，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌之间的交互作用较好，与鼠伤寒沙门氏菌次之38％，与李斯特菌的交互凝集率最低31％。此植物乳杆菌ZJUFT34的与致病菌交互凝集作用能使其在肠道中与致病菌较好的凝集，并顺利排出体外，有利于肠道健康。6、抑菌特性研究使用琼脂孔扩散法Well-diffiisionAgarAssay测定菌株的抑菌能力。取20mL灭菌冷却45℃的TSA培养基与200uL致病菌液105-106cfumL—起倒入平板混匀，待凝固后于平板上打孔，孔径为8mm。将已制备好的无菌上清液将培养好的菌液离心，取上清液用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，置于-80℃备用100uL分别加入孔中，以等体积已灭菌的PBS为对照，置于4℃下扩散12h，取出放入37℃培养24h。测量其抑菌圈直径。LactobacillusplantarumZJUFT34对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌4种常见致病菌具有一定的抑制能力见表3，其中对金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑制能力较好，李斯特菌次之，对大肠杆菌的抑制能力最差。表3LactobacillusplantarumZJUFT34抑制致病菌能力7、益生菌灌胃小鼠提高粪便含水量以LactobacillusplantarumZJUFT34每天灌胃200uL含有5*108cfu活菌，对照组灌胃200uL生理盐水，饲喂3周、5周时采集自由排便20min的粪便，105℃烘干6小时，进行含水量的测定，结果见表4。表4LactobacillusplantarumZJUFT34饲喂小鼠粪便含水量LactobacillusplantarumZJUFT34饲喂小鼠3周后，粪便含水量为58.61％，显著高于对照组p0.05，饲喂5周时，粪便含水量为53.74％，比3周时的含水量有下降，但仍显著高于对照组p0.05。提高粪便中含水量具有防治便秘的潜力。8、LactobacillusplantarumZJUFT34发酵乳能力活化后的T34和LGG鼠李糖乳杆菌，对照菌株调整菌浓度并用生理盐水进行清洗2次，加入到200mL的脱脂乳培养基脱脂乳11.5％，葡萄糖0.75％，蔗糖5％wv中，使最终菌浓度为1.5-2*107cfumL脱脂乳，每种处理做3个平行，放置在37℃中培养，并于0、6、12、18、24h取样测定发酵指标；随后放置在4℃冰箱中，于1周、2周后取样测定。如图4、5所示，LactobacillusplantarumZJUFT34发酵乳过程中，使pH从6.6降低到4.3左右，且在保存过程中抑制维持4.3左右。与阳性对照菌株LGG相比，LactobacillusplantarumZJUFT34降低pH相对较缓慢，但最后均维持在4.3左右。如图6、7所示，发酵乳过程中TTA从18增加到105。与阳性对照菌株LGG相比，LactobacillusplantarumZJUFT34前期增加TTA较缓慢，但发酵12h后，增加速率较高且高与LGG，最后均维持在110左右。如图8、9所示，发酵乳过程中，LactobacillusplantarumZJUFT34具有较高的蛋白水解能力。从整个发酵周期及保存周期来看，LactobacillusplantarumZJUFT34分解得到的丝氨酸含量均显著高于LGGp0.05，说明此LactobacillusplantarumZJUFT34具有较高的分解蛋白的能力。表5LactobacillusplantarumZJUFT34发酵乳菌落分析由上表可知，37℃发酵24h结束时，LactobacillusplantarumZJUFT34活菌数显著低于LGG，在后期4℃保存中，虽然两种菌的活菌都有所下降，但LactobacillusplantarumZJUFT34活菌数仍低于LGG。对于发酵乳质构的分析，在保存7天时，进行了持水能力脱水收缩率的测定，从表6中可以看出，两种菌发酵乳的持水能力没有显著性差距，LactobacillusplantarumZJUFT34的脱水收缩率为36％。表6LactobacillusplantarumZJUFT34发酵乳质构分析9、LactobacillusplantarumZJUFT34发酵豆乳能力T34菌粉按照最终菌浓度为1.5-2*107cfumL，加入到200mL的豆乳培养基豆乳11.5％，葡萄糖0.75％，蔗糖5％wv中，做3个平行，放置在37℃中培养，并于0、12、18、24h取样测定发酵指标；24h取样测微生物含量。如图10所示，LactobacillusplantarumZJUFT34发酵豆乳过程中，发酵12h时，pH从7.71降低到4.09左右，随后12h降到3.58。如图11所示，发酵豆乳前12h，TTA从1.8增加到52，随后12h过程中增加到接近100。表7LactobacillusplantarumZJUFT34发酵豆乳菌落分析由上表可知，37℃发酵24h结束时，LactobacillusplantarumZJUFT34活菌数为8.31logcfumL。与发酵乳相比，发酵豆乳过程中pH降低幅度更大，滴定酸TTA的增加较少，最后的T34活菌数也相对略低。但最终也较好得呈现了与发酵乳相类似的产品。序列表110浙江大学，浙江全植生物科技有限公司120植物乳杆菌ZJUFT34及其应用1412017-12-221601170SIPOSequenceListing1.021012111492212DNA213LactobacillusplantarumZJUFT344001cttaggcggctggttcctaaaaggttaccccaccgactttgggtgttacaaactctcatg60gtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcg120attactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaatg180gctttaagagattagcttactctcgcgagttcgcaactcgttgtaccatccattgtagca240cgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccgg300tttgtcaccggcagtctcaccagagtgcccaacttaatgctggcaactgataataagggt360tgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcac420cacctgtatccatgtccccgaagggaacgtctaatctcttagatttgcatagtatgtcaa480gacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgg540gcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggaatgctta600atgcgttagctgcagcactgaagggcggaaaccctccaacacttagcattcatcgtttac660ggtatggactaccagggtatctaatcctgtttgctacccatactttcgagcctcagcgtc720agttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttca780ccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgca840cttcttcggttgagccgaaggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgcttt900acgcccaataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgta960gttagccgtggctttctggttaaataccgtcaatacctgaacagttactctcagatatgt1020tcttctttaacaacagagttttacgagccgaaacccttcttcactcacgcggcgttgctc1080catcagactttcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggc1140cgtgtctcagtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgtatcattgccatg1200gtgagccgttaccccaccatctagctaatacgccgcgggaccatccaaaagtgatagccg1260aagccatctttcaaactcggaccatgcggtccaagttgttatgcggtattagcatctgtt1320tccaggtgttatcccccgcttctgggcaggtttcccacgtgttactcaccagttcgccac1380tcactcaaatgtaaatcatgatgcaagcaccaatcaataccagagttcgttcgacttgca1440tgtattaggcacgccgccagcgttcgtcctgagccaggtaccaaacactcca1492

权利要求：1.植物乳杆菌LactobacillusplantarumZJUFT34，该植物乳杆菌的保藏号为：CCTCCNO:M2017399。2.如权利要求1所述的植物乳杆菌ZJUFT34在制备抑制胃肠道致病菌的药物或食品中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述胃肠道致病菌为金黄色葡萄球菌。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述胃肠道致病菌为鼠伤寒沙门氏菌。5.如权利要求1所述的植物乳杆菌ZJUFT34在制备预防或治疗便秘的药物或食品中的应用。6.如权利要求2或5任一项所述的应用，其特征在于，所述药物由植物乳杆菌ZJUFT34菌剂与在药学上可接受的载体组成。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌ZJUFT34菌剂为将含有所述植物乳杆菌ZJUFT34的菌液通过冷冻干燥制得的粉剂，其中含有＞1011CFUg的活性植物乳杆菌ZJUFT34。8.如权利要求1所述的植物乳杆菌ZJUFT34在生产发酵乳制品中的应用。9.如权利要求1所述的植物乳杆菌ZJUFT34在生产发酵豆乳制品中的应用。

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