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申请/专利权人：山东农业大学

摘要：本发明提供了单链环状DNA病毒Gyrovirus 3GyV3的亚单位疫苗及其制备方法，该疫苗为两种，一种为VP190‑463蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；一种为VP190‑463‑linker‑VP2融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；上述两种亚单位疫苗为基因工程亚单位疫苗，无副作用可以引起较高的抗体滴度及对GyV3病毒有良好抵抗效果，可以广泛的应用于GyV3引起的传染性腺胃炎的免疫预防工作中。

主权项：1.单链环状DNA病毒GyV3的亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗为VP190‑463蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

全文数据：单链环状DNA病毒GyV3的亚单位疫苗及其制备技术领域本发明涉及分子免疫学和病毒学领域，具体涉及了单链环状DNA病毒GyV3的亚单位疫苗及其制备。背景技术近年来传染性腺胃炎给养禽业带来了巨大的危害，其可发生于不同品种的蛋鸡和肉鸡，病流行较广，发病地区发病率一般为7％～28％，死亡率一般为30％～50％。临床病鸡以极度消瘦、腺胃肿大，粪便过料为主要症状，但其病原众说纷纭，一直未有定论，在这种情况下，无法采用更好的免疫预防手段来防控传染性腺胃炎，给家禽养殖业带来了极大的危害，也成为本领域技术人员急需要解决的问题之一。发明内容针对现有存在的上述问题，本发明提供了一种单链环状DNA病毒GyV3的亚单位疫苗及其制备，该疫苗为两种，一种为VP190-463蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；一种为VP190-463-linker-VP2融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；上述两种亚单位疫苗为基因工程亚单位疫苗，无副作用可以引起较高的抗体滴度及对GyV3病毒有良好免疫效果，可以广泛的应用于传染性腺胃炎的免疫预防工作中。本发明是基于下述理论基础进行的深入研究获得的：环状病毒GyV3GenBank登录号MG366592，首先公开于下述现有技术中JournalofGeneralVirology2012,93,1356–1361，根据其记载，该病毒是在一例儿童腹泻病例中发现的，之后没有进行相关研究，因此除上述公开文献外，其研究一直处于空白状态，本发明的发明人首次在2017年获得了患有鸡传染性腺胃炎的病鸡，通过患腺胃炎病鸡腺胃的高通量测序，在上述患有传染性腺胃炎鸡中鉴定出了上述的GyV3病毒GenBank登录号MG366592。目前，GyV3在鸡群中第二个被鉴定的单链环状DNA病毒，第一个单链环状DNA病毒是鸡传染性贫血病毒。发明人通过回归动物实验，发现GyV3病毒可以引起鸡免疫抑制、贫血以及腺胃肿大等传染性腺胃炎的典型症状，可以确定两者之间的关系，因此发明人决定制备GyV3病毒亚单位疫苗进行免疫原性研究，对动物进行保护；进而获得了本发明的技术方案；根据现有技术可知，GyV3病毒属于单股环状DNA病毒，由三个开放阅读框构成，分别为VP11392bp,VP2720bp和VP3378bp，本发明选取GyV3的囊膜蛋白VP1为目标蛋白，为实现其在大肠杆菌中大量表达，将N’端稀有密码子去除，选取VP1蛋白第90位至463位氨基酸进行表达以制备亚单位疫苗；除此之外，发明人还发现，该病毒的VP1蛋白和VP2蛋白可以相互作用，无结构的VP2蛋白在病毒粒子组装中扮演者骨架蛋白的角色，对结构蛋白VP1的抗原表位产生作用。VP1和VP2共同表达可以起到更好的保护作用，因此除了上述单独选用VP1蛋白第90位至463位氨基酸进行表达以制备亚单位疫苗之外，还提供了选择VP1和VP2作为制备疫苗的目标蛋白的技术方案，发明人将其进行了分别的表述如下：1.选取VP1蛋白第90位至463位氨基酸进行表达以制备亚单位疫苗：发明人对GyV3病毒进行研究后发现，该GyV3病毒VP1整个CDS区编码463个氨基酸，65-82aa为跨膜区，无信号肽序列，局部亲水性较好，由于跨膜区对蛋白表达影响较大，发明人选取90-463aa进行表达，即VP190-463蛋白，利用该片段即可作为亚单位疫苗使用，其具体获得方法发明人记载在了实施例中；该亚单位疫苗为VP190-463蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，其编码核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；2.选取VP1蛋白第90位至463位氨基酸和VP2共同进行表达以制备亚单位疫苗：在选取上述VP190-463aa进行表达的基础上，进一步克隆VP2整个CDS区，将VP2与VP190-463通过linker:Gly3Ser2GSGGS串联，表达获得VP190-463-linker-VP2融合蛋白，以该融合蛋白作为亚单位疫苗，其具体获得方法发明人记载在了实施例中；该亚单位疫苗，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，其编码核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；利用上述制备的亚单位疫苗免疫家禽，再用GyV3病毒进行攻毒，发现制备的疫苗可以对动物起到良好的保护作用。综上所述，本发明的发明人在首次发现GyV3病毒与传染性腺胃炎之间的致病机理基础上，以GyV3病毒的VP1和VP2为研究对象，获得了两种具有较好预防效果的亚单位疫苗，该疫苗无副作用可以引起较高的抗体滴度及对GyV3病毒有良好免疫效果，可以广泛的应用于传染性腺胃炎的免疫预防工作中。附图说明图1为实施例1中VP190-463基因电泳图；图2为实施例1中PET32a-VP190-463酶切鉴定电泳图；图3为实施例2中VP190-463蛋白SDS-PAGE图；图4为实施例2中VP190-463Westernblot鉴定图；图5为实施例3中抗体消长规律分析图；图6为实施例3中鸡群体重检测图；图7为实施例4中VP190-463-linker-VP2中VP190-463基因电泳图；图8为实施例4中VP190-463-linker-VP2中VP2基因电泳图；图9为实施例4中VP190-463-linker-VP2重叠延伸图；图10为实施例4中PET32a-VP190-463-linker-VP2酶切鉴定图；图11为实施例5中VP190-463-linker-VP2蛋白SDS-PAGE图；图12为实施例5中VP190-463-linker-VP2蛋白Westernblot鉴定图；图13为实施例6中抗体消长规律分析图；图14为实施例6中鸡群体重检测图；图中的1为酶切前，2为酶切后。具体实施方式本实施例中除特殊说明外，其他均采用现有技术完成。实施例1VP190-463原核表达载体的构建目的片段的克隆根据genbank登录号MG366592公开的GyV3序列，获得GyV3病毒VP190-463基因的序列，设计并合成引物，同时引入限制性酶切位点SacINotI，引物由华大基因合成。引物序列如下:F–CGAGCTCGACACAACTAAAGGCAA，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；R-TTGCGGCCGCCTAGTCTGCGGGGACGC，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；称取30mgGyV3感染的鸡的肿大的腺胃组织，使用天根公司的提取组织DNA，按如上引物进行目的条带的扩增，反应体系为：水10.5μL、dNTPMixture12.5μL、上、下游引物各0.5μL、DNA模板1μL；反应条件为95℃预变性5min；95℃30s，54℃30s，72℃1min10s，32个循环；72℃延伸10min；得到的PCR产物进行凝胶电泳,得到单一的目的条带，大小为1119bp如图1所示，进行胶回收。重组质粒的构建1将VP190-463胶回收产物与表达载体pET-32a+用SacI和NotI37℃双酶切1h,电泳胶回收产物；16℃过夜连接构建重组质粒pET-32a-VP190-463；2将DH5α冰上解冻5min,加入连接后的重组质粒10μl,混匀后冰浴30min.然后42℃水浴90S后迅速冰浴3min；3向管中加入800μl含氨苄的LB培养基，摇床1h后4000rpm,5min离心，弃800μl,余200μl涂板置于37℃恒温培养箱中过夜培养；挑取单菌落，摇菌6h-7h送华大测序，测得VP190-463核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。测序正确的质粒进行双酶切鉴定。泳道1为酶切后，可见pET-32a+空载条带和1119bp的目的条带VP190-463：泳道2为重组载体pET-32a-VP190-463的单一条带，表示重组质粒的构建成功图2所示，按如上方法将重组质粒转化入BL21感受态细胞中进行表达。实施例2VP190-463的表达，纯化与复性1、诱导表达挑取转化入重组质粒pET-32a-VP190-463的BL21感受态细胞，37℃恒温培养箱中过夜培养。第二日将菌液按1：50比例接种于2L的锥形瓶中，于摇床中37℃培养OD600nm约为0.6，取出10mL未诱导的菌液做对照，加入IPTG终浓度1mmolL进行诱导表达，于摇床中继续培养2h后5000rpm,10min离心收集菌体。加入40mlPBS重悬菌体，加入1％PMSF冰浴超声破碎，破碎2S，冷却4S，时间为30min，12000rpm,离心10min,收集包涵体弃上清。2、蛋白纯化与复性1用9倍体积的洗涤液I500mmolLTris-ClPH＝8.0，100mmolLNaCl，100mmolLEDTA，重悬沉淀，静置15min后，12000rpm，15min弃上清。2用9倍体积的洗涤液II洗涤液I中加入2M的尿素重悬沉淀，静置15min后，12000rpm，15min，弃上清。3用9倍体积的洗涤液III洗涤液I中加入4M的尿素重悬沉淀，静置5min后，12000rpm，15min，弃上清。4按20mL溶解液洗涤液I中加入8M的尿素，室温溶解1h；12000rpm，离心15min。取上清，即为溶解的包涵体。5上清置于透析袋中，依次置于含有尿素为6mol,4mol，2mol,0mol梯度溶液中，4℃过夜透析，使蛋白复性。6SDS-PAGE法检测纯化后的目的蛋白纯度。经过表达纯化后可以得到较为单一的目的蛋白，大小为62kD，即为目的蛋白VP190-463蛋白如图3所示。以及以抗HIS标签的抗体为一抗进行Westernblot进一步的鉴定：目的蛋白可以和鼠抗HIS标签抗体特异性结合如图4所示。用分光光度法测得的VP190-463蛋白浓度为1.5mgml。实施例3VP190-463亚单位疫苗的应用1、抗体水平检测将疫苗与弗氏佐剂按照1:1比例进行振荡混匀，然后超声破碎混匀，直至免疫原滴在冰水里聚集成滴，并且长时间不扩散为止。购买SPF鸡一周龄进行一免，每只鸡免疫蛋白量0.1mg。三周龄进行二免，五周龄日龄进行三免。颈部皮下进行多点免疫，增强免疫效果。每周采血，分离血清。用VP190-463建立间接ELISA方法测定抗体水平。一免后两周二免后抗体水平开始上升，第五周开始下降。三免后两周抗体水平又开始上升，随后下降图5。VP190-463蛋白引起鸡体的抗体效价达1：25600；重组蛋白免疫动物后，可以明显刺激机体产生免疫反应，说明蛋白具有良好的免疫原性。每周称取鸡群体重，疫苗组和对照组没有明显的差别，说明注射疫苗后并不影响鸡群的生产性能图6。2、GyV3的攻毒保护购买SPF鸡随机分为三组：VP190-463疫苗组，接毒对照组和空白对照组。VP190-463疫苗组用制备的上述VP190-463亚单位疫苗免疫。在第六周龄对VP190-463疫苗组和接毒对照组进行GyV3攻毒。第八周采血，分离血清，使用天根公司的提取血清DNA，用GyV3鉴定引物F:GACACAGACTGCGACGAAGAR:ATGCTCCTGGCTGTCTAGAT进行GyV3的PCR鉴定。结果发现用制备的上述VP190-463亚单位疫苗免疫家禽，再用GyV3病毒进行攻毒，制备的疫苗可以对动物起到100％的保护作用；VP190-463动物保护率统计表实施例4VP190-463-linker-VP2原核表达载体的构建目的片段的克隆根据genbank登录号MG366592公开的环状病毒GyV3序列，获得GyV3病毒VP190-463和VP2基因的序列，设计并合成引物，同时引入限制性酶切位点SacINotI，引物由华大基因合成。引物序列如下:VP190-463-F–CGAGCTCGACACAACTAAAGGCAA，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；VP190-463-R-GGAGCCTCCGGAACGGCGTCTGCGGGGACG划线序列为Linker，其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；VP2-F-GGTTCCGGAGGCTCCATGTCATCCGGCGGTCT划线序列为Linker，其核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；VP2-R-TTGCGGCCGCTTACCAGGTAAGATCCCG，其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；称取30mgGyV3感染的鸡的肿大的腺胃组织，使用天根公司的提取组织DNA，按如上引物进行目的条带的扩增，使用VP190-463特异性引物扩增VP190-463基因，VP190-463-2和VP2特异性引物进行重叠延伸PCR扩增VP1-linker-VP2基因。反应体系为：水10.5μL、dNTPMixture12.5μL、上、下游引物各0.5μL、DNA模板1μL。VP190-463反应条件为95℃预变性5min；95℃30s，54℃30s，72℃1min10s，32个循环；72℃延伸10min。VP190-463-2反应条件为95℃预变性5min；95℃30s，54℃30s，72℃1min10s，32个循环；72℃延伸10min；VP2反应条件为95℃预变性5min；95℃30s，53℃30s，72℃50s，32个循环；72℃延伸10min。得到的PCR产物进行凝胶电泳，目的条带VP190-463为1119bp如图7所示,目的条带VP2为720bp如图8所示，条带单一进行胶回收。为了扩增VP190-463-linker-VP2，将VP190-463特异性引物和VP2特异性引物扩增的条带胶回收产物各取1μl，水9.5μl、dNTPMixture12.5μl、VP190-463-F和VP2-R引物各0.5μl，反应条件为95℃预变性5min；95℃30s，54℃30s，72℃2min，32个循环；72℃延伸10min。得到的重叠延伸PCR产物进行凝胶电泳，目的条带VP190-463-linker-VP2为1851bp如图9所示，条带单一进行胶回收。2.重组质粒的构建将VP190-463-linker-VP2胶回收产物与表达载体pET-32a+用SacI和NotI37℃双酶切1h,电泳胶回收产物。16℃过夜连接构建重组质粒ET-32a-VP190-463-linker-VP2。将DH5α冰上解冻5min,加入连接后的重组质粒10μl,混匀后冰浴30min.然后42℃水浴90S后迅速冰浴3min。向管中加入800μl含氨苄的LB培养基，摇床1h后4000rpm,5min离心，弃800μl,余200μl涂板置于37℃恒温培养箱中过夜培养。挑取单菌落，摇菌6h-7h送华大测序。测得VP190-463-linker-VP2核苷酸序列为SEQIDNO.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。测序正确的质粒进行双酶切鉴定.泳道1为酶切后，可见pET-32a+空载条带和1851bp的目的条VP190-463-linker-VP2：泳道2为重组载体pET-32a-VP190-463-linker-VP2的单一条带，表示重组质粒的构建成功如图10所示，按如上方法将重组质粒转化入BL21感受态细胞中进行表达。实施例5VP190-463-linker-VP2蛋白的表达，纯化与复性1、诱导表达挑取转化入重组质粒pET-32a-VP190-463-linker-VP2的BL21感受态细胞，37℃恒温培养箱中过夜培养。第二日将菌液按1：50比例接种于2L的锥形瓶中，于摇床中37℃培养OD600nm约为0.6，取出10mL未诱导的菌液做对照，加入IPTG终浓度1mmolL进行诱导表达，于摇床中继续培养2h后5000rpm,10min离心收集菌体。加入40mlPBS重悬菌体，加入1％PMSF冰浴超声破碎，破碎2S，冷却4S，时间30min.12000rpm,离心10min,收集包涵体弃上清。2、蛋白纯化与复性1用9倍体积的洗涤液I500mmolLTris-ClPH＝8.0，100mmolLNaCl，100mmolLEDTA，重悬沉淀，静置15min后，12000rpm，15min弃上清。2用9倍体积的洗涤液II洗涤液I中加入2M的尿素重悬沉淀，静置15min后，12000rpm，15min，弃上清。3用9倍体积的洗涤液III洗涤液I中加入4M的尿素重悬沉淀，静置5min后，12000rpm，15min，弃上清。4按20mL溶解液洗涤液I中加入8M的尿素，室温溶解1h；12000rpm，离心15min。取上清，即为溶解的包涵体。5上清置于透析袋中，依次置于含有尿素为6mol,4mol，2mol,0mol梯度溶液中，4℃过夜透析，使蛋白复性。6SDS-PAGE法检测纯化后的目的蛋白纯度。经过表达纯化后可以得到较为单一的目的蛋白，大小为90kD如图11所示。以及以抗HIS标签的抗体为一抗进行Westernblot进一步的鉴定。结果发现目的蛋白可以和鼠抗HIS标签抗体特异性结合如图12所示。用分光光度法测得的VP190-463-linker-VP2浓度为：1.6mgml.。实施例6VP190-463-linker-VP2亚单位疫苗的应用抗体水平检测将疫苗与弗氏佐剂按照1:1比例进行振荡混匀，然后超声破碎混匀，直至免疫原滴在冰水里聚集成滴，并且长时间不扩散为止。购买SPF鸡7日龄进行一免，每只鸡免疫蛋白量0.1mg。21日龄进行二免，35日龄进行三免。颈部皮下进行多点免疫，增强免疫效果。每周采血，分离血清。用VP190-463-linker-VP2蛋白建立间接ELISA方法测定抗体水平，一免后两周二免后一直到第八周抗体水平一直波动上升，第八周又开始下降图13。VP190-463-linker-VP2蛋白引起鸡体的抗体效价达1:12800。重组蛋白免疫动物后，可以明显刺激机体产生免疫反应，说明蛋白具有良好的免疫原性。每周称取鸡群体重，疫苗组和对照组没有明显的差别，说明注射疫苗后并不影响鸡群的生产性能图14。GyV3的攻毒保护购买SPF鸡随机分为三组：VP190-463-linker-VP2疫苗组，接毒对照组和空白对照组。VP190-463-linker-VP2疫苗组用制备的上述VP190-463-linker-VP23亚单位疫苗免疫。在第六周龄对VP190-463-linker-VP2疫苗组和接毒对照组进行GyV3攻毒。第八周采血，分离血清，使用天根公司的提取血清DNA，用GyV3鉴定引物F:GACACAGACTGCGACGAAGAR:ATGCTCCTGGCTGTCTAGAT进行GyV3的PCR鉴定。结果发现用制备的上述VP190-463亚单位疫苗免疫家禽，再用GyV3病毒进行攻毒，制备的疫苗可以对动物起到95％的保护作用：VP190-463-linker-VP2动物保护率统计表序列表110山东农业大学120单链环状DNA病毒GyV3的亚单位疫苗及其制备1609170SIPOSequenceListing1.021012111119212DNA213人工序列4001gacacaactaaaggcaaaaacgttacaacaactaatgtggcactaattaacgttaacctg60aaagagttcttctgggccacactgccactagacgcaaggtcaaagattggaggacccaac120cccttcccacaacacatccagggatgtgactgggcgggcatagccacaacccacaaaggc180tgctggccatacagtacacaaatgtcatcatctagacagccaggggcatggccttcagaa240tggtggcgatgggcacttcttcttatgcatcctagatccaatgtacgattcttcggatcc300ccgaaactgatgaccctaccacaaataggacagttcctggggggctggcaactattcacc360cacagattcacaaaattccgtgtgcttgcaactaagagcagagaatcgttctccccggtc420gcgagcctgcttgtacaagacaattactttgcaagaagagagggtgcagggccaccaata480tcgggacaaccaccaatgtgcaccatgcaaagacttacgagagactatacaggcacagaa540agcaatgctccagctaatgaaaccacaataccatccatgccaccagacccaccccaatac600cccgctcaaaccggctgcagcacggcggtagaccctggtgaatacctcctcgcaggactc660acacgtacagcagtatcctgctggtattcacgctcaacatacccaagctttgctacgcta720tcagcactaggggcaccatggtcattcccagcaggacagaagtcaatcagcaaaacatcc780ttcaacaaacatgtcattagaggcatgggtgacccacaaggcaaaaaatggctcaccctg840gtaccgaaagaacaagaatggatcaattcggactcaatgacaaagtcagaactggacacg900gacatagctacattgtacctagctcaaggaacaagcagagcaaacagctacaaattcaac960acattccacgaggtaatggtacaagaccccatgaatgtagccccctgggcagtcgtcaaa1020gtctccagcgtctggacactcggcaacaacagaagaccatacccatgggatgtcaactgg1080tacaacgaattcactgcagaaggccgcgtccccgcagac11192102211373212PRT213人工序列4002AspThrThrLysGlyLysAsnValThrThrThrAsnValAlaLeuIle151015AsnValAsnLeuLysGluPhePheTrpAlaThrLeuProLeuAspAla202530ArgSerLysIleGlyGlyProAsnProPheProGlnHisIleGlnGly354045CysAspTrpAlaGlyIleAlaThrThrHisLysGlyCysTrpProTyr505560SerThrGlnMetSerSerSerArgGlnProGlyAlaTrpProSerGlu65707580TrpTrpArgTrpAlaLeuLeuLeuMetHisProArgSerAsnValArg859095PhePheGlySerProLysLeuMetThrLeuProGlnIleGlyGlnPhe100105110LeuGlyGlyTrpGlnLeuPheThrHisArgPheThrLysPheArgVal115120125LeuAlaThrLysSerArgGluSerPheSerProValAlaSerLeuLeu130135140ValGlnAspAsnTyrPheAlaArgArgGluGlyAlaGlyProProIle145150155160SerGlyGlnProProMetCysThrMetGlnArgLeuThrArgAspTyr165170175ThrGlyThrGluSerAsnAlaProAlaAsnGluThrThrIleProSer180185190MetProProAspProProGlnTyrProAlaGlnThrGlyCysSerThr195200205AlaValAspProGlyGluTyrLeuLeuAlaGlyLeuThrArgThrAla210215220ValSerCysTrpTyrSerArgSerThrTyrProSerPheAlaThrLeu225230235240SerAlaLeuGlyAlaProTrpSerPheProAlaGlyGlnLysSerIle245250255SerLysThrSerPheAsnLysHisValIleArgGlyMetGlyAspPro260265270GlnGlyLysLysTrpLeuThrLeuValProLysGluGlnGluTrpIle275280285AsnSerAspSerMetThrLysSerGluLeuAspThrAspIleAlaThr290295300LeuTyrLeuAlaGlnGlyThrSerArgAlaAsnSerTyrLysPheAsn305310315320ThrPheHisGluValMetValGlnAspProMetAsnValAlaProTrp325330335AlaValValLysValSerSerValTrpThrLeuGlyAsnAsnArgArg340345350ProTyrProTrpAspValAsnTrpTyrAsnGluPheThrAlaGluGly355360365ArgValProAlaAsp37021032111851212DNA213人工序列4003gacacaactaaaggcaaaaacgttacaacaactaatgtggcactaattaacgttaacctg60aaagagttcttctgggccacactgccactagacgcaaggtcaaagattggaggacccaac120cccttcccacaacacatccagggatgtgactgggcgggcatagccacaacccacaaaggc180tgctggccatacagtacacaaatgtcatcatctagacagccaggggcatggccttcagaa240tggtggcgatgggcacttcttcttatgcatcctagatccaatgtacgattcttcggatcc300ccgaaactgatgaccctaccacaaataggacagttcctggggggctggcaactattcacc360cacagattcacaaaattccgtgtgcttgcaactaagagcagagaatcgttctccccggtc420gcgagcctgcttgtacaagacaattactttgcaagaagagagggtgcagggccaccaata480tcgggacaaccaccaatgtgcaccatgcaaagacttacgagagactatacaggcacagaa540agcaatgctccagctaatgaaaccacaataccatccatgccaccagacccaccccaatac600cccgctcaaaccggctgcagcacggcggtagaccctggtgaatacctcctcgcaggactc660acacgtacagcagtatcctgctggtattcacgctcaacatacccaagctttgctacgcta720tcagcactaggggcaccatggtcattcccagcaggacagaagtcaatcagcaaaacatcc780ttcaacaaacatgtcattagaggcatgggtgacccacaaggcaaaaaatggctcaccctg840gtaccgaaagaacaagaatggatcaattcggactcaatgacaaagtcagaactggacacg900gacatagctacattgtacctagctcaaggaacaagcagagcaaacagctacaaattcaac960acattccacgaggtaatggtacaagaccccatgaatgtagccccctgggcagtcgtcaaa1020gtctccagcgtctggacactcggcaacaacagaagaccatacccatgggatgtcaactgg1080tacaacgaattcactgcagaaggccgcgtccccgcagacggttccggaggctccatgtca1140tccggcggtctaggtgatagttcggagaacgagcaactagccgctgggggcagtgaattg1200ccgcttaggcaagaggggcaacttgggcccagcggagccggatcaacgggcaagaaactt1260aaaaagcacgactctccctacctgaatggaaccgggacttggacaccagaccccaagaac1320tacagaaccatccaggtcggtgatattcgagcatccaataagttcgtcggagtcggttgg1380gactctctccaaagagatccaaattgggctcgggtcaactataattaccgtatcgcttcc1440tggcttcgcgagtgttcgcgtactcacgacgcgatctgcaactgcgggggcttcagacgc1500cactggttccaggaggcagcaggactgtccacacaggagacccagacggacccggtcgcc1560agagatctcgatcgcctggtcgtgcgtggaaacgcagcaaaaagaaaattggattacatc1620gcgaacagaaaaactcccaaaaagagaaaggctaagactgtaacatggctcgacgatttc1680gccggcacagaggaaagttcggatactacagacggggaagatggcactggagacacagac1740tgcgacgaagacgctattcccggaggcgtaaacttcgatatgcgcgtcgacgacccagtg1800ctcgcagcgttaaaaggaagatattcaacccacatccgggatcttacctgg18512104211617212PRT213人工序列4004AspThrThrLysGlyLysAsnValThrThrThrAsnValAlaLeuIle151015AsnValAsnLeuLysGluPhePheTrpAlaThrLeuProLeuAspAla202530ArgSerLysIleGlyGlyProAsnProPheProGlnHisIleGlnGly354045CysAspTrpAlaGlyIleAlaThrThrHisLysGlyCysTrpProTyr505560SerThrGlnMetSerSerSerArgGlnProGlyAlaTrpProSerGlu65707580TrpTrpArgTrpAlaLeuLeuLeuMetHisProArgSerAsnValArg859095PhePheGlySerProLysLeuMetThrLeuProGlnIleGlyGlnPhe100105110LeuGlyGlyTrpGlnLeuPheThrHisArgPheThrLysPheArgVal115120125LeuAlaThrLysSerArgGluSerPheSerProValAlaSerLeuLeu130135140ValGlnAspAsnTyrPheAlaArgArgGluGlyAlaGlyProProIle145150155160SerGlyGlnProProMetCysThrMetGlnArgLeuThrArgAspTyr165170175ThrGlyThrGluSerAsnAlaProAlaAsnGluThrThrIleProSer180185190MetProProAspProProGlnTyrProAlaGlnThrGlyCysSerThr195200205AlaValAspProGlyGluTyrLeuLeuAlaGlyLeuThrArgThrAla210215220ValSerCysTrpTyrSerArgSerThrTyrProSerPheAlaThrLeu225230235240SerAlaLeuGlyAlaProTrpSerPheProAlaGlyGlnLysSerIle245250255SerLysThrSerPheAsnLysHisValIleArgGlyMetGlyAspPro260265270GlnGlyLysLysTrpLeuThrLeuValProLysGluGlnGluTrpIle275280285AsnSerAspSerMetThrLysSerGluLeuAspThrAspIleAlaThr290295300LeuTyrLeuAlaGlnGlyThrSerArgAlaAsnSerTyrLysPheAsn305310315320ThrPheHisGluValMetValGlnAspProMetAsnValAlaProTrp325330335AlaValValLysValSerSerValTrpThrLeuGlyAsnAsnArgArg340345350ProTyrProTrpAspValAsnTrpTyrAsnGluPheThrAlaGluGly355360365ArgValProAlaAspGlySerGlyGlySerMetSerSerGlyGlyLeu370375380GlyAspSerSerGluAsnGluGlnLeuAlaAlaGlyGlySerGluLeu385390395400ProLeuArgGlnGluGlyGlnLeuGlyProSerGlyAlaGlySerThr405410415GlyLysLysLeuLysLysHisAspSerProTyrLeuAsnGlyThrGly420425430ThrThrThrProAspProLysAsnTyrArgThrIleGlnValGlyAsp435440445IleArgAlaSerAsnLysPheValGlyValGlyThrAspSerLeuGln450455460ArgAspProAsnThrAlaArgValAsnTyrAsnTyrArgIleAlaSer465470475480ThrLeuArgGluCysSerArgThrHisAspAlaIleCysAsnCysGly485490495GlyPheArgArgHisThrPheGlnGluAlaAlaGlyLeuSerThrGln500505510GluThrGlnThrAspProValAlaArgAspLeuAspArgLeuValVal515520525ArgGlyAsnAlaAlaLysArgLysLeuAspTyrIleAlaAsnArgLys530535540ThrProLysLysArgLysAlaLysThrValThrThrLeuAspAspPhe545550555560AlaGlyThrGluGluSerSerAspThrThrAspGlyGluAspGlyThr565570575GlyAspThrAspCysAspGluAspAlaIleProGlyGlyValAsnPhe580585590AspMetArgValAspAspProValLeuAlaAlaLeuLysGlyArgTyr595600605SerThrHisIleArgAspLeuThrThr610615210521124212DNA213人工序列4005cgagctcgacacaactaaaggcaa24210621127212DNA213人工序列4006ttgcggccgcctagtctgcggggacgc27210721130212DNA213人工序列4007ggagcctccggaacggcgtctgcggggacg30210821132212DNA213人工序列4008ggttccggaggctccatgtcatccggcggtct32210921128212DNA213人工序列4009ttgcggccgcttaccaggtaagatcccg28

权利要求：1.单链环状DNA病毒GyV3的亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗为VP190-463蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，其编码核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.单链环状DNA病毒GyV3的亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗为VP190-463-linker-VP2融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，其编码核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

百度查询： 山东农业大学 单链环状DNA病毒GyV3的亚单位疫苗及其制备