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申请/专利权人：昆明理工大学

摘要：本发明公开了一种三七病程相关蛋白PnPR3的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质；本发明通过向烟草中转入外源基因PnPR3使其在烟草中得到表达，实验表明PnPR3基因的过量表达，对典型根腐病病菌腐皮镰刀菌有一定的抑制作用；本发明的基因可以转入植物中提高植物的抗病性，可以提高烟草对根腐病致病菌腐皮镰刀菌的抗性，为根腐病植物抗病育种打下良好的工作基础，具有较高的经济效益。

主权项：1.一种三七病程相关蛋白PnPR3的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质。

全文数据：三七病程相关蛋白PnPR3的基因及其应用技术领域本发明涉及一种三七病程相关蛋白PnPR3的编码基因及其应用，包括三七病程相关蛋白基因PnPR3及其编码的蛋白质以及含有该基因的载体和植物细胞系。背景技术三七受到致病菌的侵染后，植物中的一系列基因响应而上调表达，其中的一些基因与防御反应相关，包括病程相关蛋白（PR）和抑菌基因，其通过增强其蛋白活性来提高抗病能力；PR蛋白被认为可被病原菌和非生物胁迫诱导；根据PR蛋白的结构和功能，目前PR蛋白在单子叶植物和双子叶植物中被发现并已确认了17个家族。在这些PR蛋白中，PnPR3蛋白参与了碳水化合物代谢过程，几丁质催化过程和细胞壁大分子催化过程等生物学过程，该蛋白具有几丁质酶活性和几丁质绑定活性等分子功能。三七Panaxnotoginseng是我国特有的传统名贵中药材，多年来，其规模化种植主要存在连作障碍的问题，受到根腐病、白粉病、圆斑病等病害的严重限制，其中，以根腐病为主要病害，其常年发病率为5%～20%，在三七连作土上继续种植严重的可达80%以上，甚至绝收，根腐病发病后会导致根部腐烂，地上部分枯黄萎蔫，严重影响了三七的产量和药材品质。目前根腐病的控制手段主要以大量施用抗菌性农药为主，根腐病的无害化防治已经成为了三七栽培技术研究的热点和难点问题。三七根腐病病原菌比较复杂，一般为复合侵染，致病菌包括细菌中的假单胞杆菌pseudomonassp.、真菌中的坏损柱孢菌Cylindrocarpondestructans,C.didynum、镰刀菌Fusariumsolani,Fusariumsolanif.sp.Radicicola,F.oxysporumSchlecht.,F.scirpilamb.等，通常以坏损柱孢菌、镰刀菌或假单胞菌中某一类为主，数种病原菌复合侵染，加速根系腐烂。根腐病对三七的产量影响之巨大是目前三七种植业的主要瓶颈之一。由于目前根腐病的防治主要通过施用大量化学农药的方法，对药材品质和安全性有一定程度的影响；目前未见与本发明相关的报道。发明内容本发明的目的是提供一种从三七中克隆获得病程相关蛋白基因PnPR3，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，该基因cDNA全长序列为918bp，编码如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的蛋白质。本发明三七病程相关蛋白PnPR3也可以是将序列表中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与植物抗病相关的蛋白质。本发明另一目的是将上述三七病程相关蛋白PnPR3的基因应用在提高植物抗病性中。本发明三七病程相关蛋白PnPR3基因可用现有的方法构建到现有的原核表达载体或植物表达载体中，可在其转录起始核苷酸前加上包括组成型启动子、增强型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、发育阶段特异型启动子在内的任何一种启动子，为了便于对转PnPR3基因细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记物（氨苄青霉素、庆大霉素、卡那霉素等）或加入植物可选择性标记（GUS基因、荧光素酶基因等）。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、烟草等；携带有本发明的PnPR3基因的表达载体可通过施用植物病毒载体、直接DNA转化、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培养成植株，获得抗病性提高的植株。本发明通过向烟草中转入外源基因PnPR3使其在烟草中得到表达，实验表明PnPR3基因的过量表达，对典型根腐病病菌腐皮镰刀菌（Fusariumsolani）有一定的抑制作用；本发明的基因可以转入植物中提高植物的抗病性，可以提高烟草对根腐病致病菌腐皮镰刀菌（Fusariumsolani）的抗性，为根腐病植物抗病育种打下良好的工作基础，具有较高的经济效益。附图说明图1为从根腐病菌诱导的三七主根中扩增PnPR3基因片段的电泳图；图2为PnPR3蛋白保守结构域预测；图3为PnPR3基因进化树分析图；图4为植物表达载体pK2GW7-35S-PnPR3构建结果验证；A图为PnPR3片段胶回收；B图中1.pENTRTM2B空载质粒；2.入门克隆质粒pENTRTM2B双酶切；C图为pK2GW7-35S-PnPR3菌液PCR检测；D图为pK2GW7-35S-PnPR3质粒提取；图5为农杆菌菌落的PCR电泳检测示意图；图6为PCR检测转基因烟草筛选图；图7为转基因植物中PnPR3基因的PR-PCR验证；1：野生型烟草基因组DNAPCR电泳（负对照）；2：水PCR电泳（空白）；3：pMD-18TPnPR3质粒电泳（正对照）；4~7：分别依次为4号，6号，9号，11号植株DNAPCR电泳；图8为过表达PnPR3转基因烟草对腐皮镰刀菌的抗性图；图9为过表达PnPR3转基因烟草的几丁质酶活性图。具体实施方式下面所述的实施例中的试验方法如无特殊说明均为常规方法，所用试剂如无特殊说明均为常规市售试剂以及按常规方法配置的试剂。实施例1：三七病程相关蛋白PnPR3保守片段及其cDNA全长的获得转录组测序筛选出表达差异显著的病程相关蛋白PR3，从CDS文件中获得PnPR3的拼接序列，将此片段用MEGA软件和三七相近的物种人参的全长PR3序列进行分析，发现该片段具有3’端和5’端。因此，本实验只需对cDNA序列进行高保真PCR扩增，就可获得该基因的全长序列；设计特异引物PR3-F（5’-GGATCCatgagattttggacagtaaccatattc-3’，GGATCC为BamHI酶切位点）和PR3-R（5’-CAGCTGtagacctaaacctaaaccattaaatatgg-3’，GTCGAC为SalI酶切位点），采用大连宝生物公司提供的高保真PCR反应酶扩增该基因的开放阅读框，得到1000bp左右大小的条带，与目的基因的大小相符；从琼脂糖凝胶中回收DNA片段，连接pMD-18T克隆载体，转化到E.coliDH5α中，进行菌落PCR检测，提取质粒，进行双酶切检测，确定能被切开后，将质粒送至昆明擎科生物有限公司进行测序；最终确定PnPR3基因的开放阅读框并获得含酶切位点的cDNA片段（如SEQIDNO:1所示）。将三七病程相关蛋白基因PnPR3序列输入NCBI中的ORF（OpenReadingFrameFinder）www.ncbi.nlm.nih.govgorfgorf.html和DNAMAN软件分析序列，结果显示PnPR3基因全长918bp，编码305个氨基酸（如SEQIDNO:1所示）；同时，用ExPASY（ProtParam）软件分析PnPR3编码的蛋白质分子量为33393.25道尔顿，理论pI值为6.41，分子式为C1471H2200N408O449S19；PnPR3的305个氨基酸中含有26个碱性氨基酸（R,H,K），23个酸性氨基酸（D,E），非极性、疏水性氨基酸（G,A,V,L,I,F,P）有132个，非电离的极性、中性氨基酸（W,S,T,C,Y,M,N,Q）有124个；其中带负电荷的氨基酸包括D和E，共计23个，带正电荷的氨基酸包括R、H和K，共26个。利用在线工具InterPro（http:www.ebi.ac.ukinterprosearchsequence-search）对PnPR3蛋白预测保守结构域进行分析，发现PnPR3蛋白全长是一个保守结构域家族，为糖基水解酶家族19（Glycosidehydrolase,family19IPR016283）。该家族被认为只含有几丁质酶活性。该家族含有一个Chitin-binding，type1结构（IPR001002）位于21~57位，1个Lysozyme-likedomain（溶菌酶）（IPR023346）结构，位于66~305位。该蛋白含有四个区域具有几丁质酶催化活性，分别位于211~221位、69~298位、70~298位、87~109位，在31~50位还含有一个保守位点Chitin-binding，type1。PnPR3蛋白本体（GO）预测表明，该蛋白参与了碳水化合物代谢过程（carbohydratemetabolicprocess），几丁质催化过程（chitincatabolicprocess）和细胞壁大分子催化过程（cellwallmacromoleculecatabolicprocess）等生物学过程；该蛋白具有几丁质酶活性（chitinaseactivity）和几丁质绑定活性（chitinbinding）等分子功能。利用DNAMAN软件进行同源性分析，将三七PnPR3蛋白与人参、胡萝卜、核桃、菠菜、可可、木豆等的蛋白构建了系统发育树，见图3；三七PnPR3蛋白与人参PR3蛋白（登录号：ACN96317.1）聚为一类，表现较近的亲缘关系。实验例2：三七病程相关蛋白基因PnPR3植物表达载体pK2GW7-35S-PnPR3的构建将测序检测正确的pMD-18T-PnPR3载体质粒用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切，回收PnPR3基因片段；将pENTRTM2B质粒用限制性内切酶BamHI和SalI进行双酶切，回收线性载体片段；将回收的PnPR3基因片段和回收后的线性质粒载体进行连接，可成功构建pENTR-PnPR3入门载体；将该入门表达载体进行酶切检测按照Gateway试剂盒操作说明，将构建好的入门载体与植物表达载体pK2GW7.0进行LR反应，可成功构建pK2GW7-35S-PnPR3植物表达载体；将该植物表达载体进行PCR检测，酶切检测，质粒进行测序，验证该基因没有发生突变后进行下一步实验（图4）。实验例3：用pK2GW7-35S-PnPR3植物表达载体转化农杆菌制备农杆菌感受态细胞，用电击转化法将上述构建好的植物表达载体pK2GW7-35S-PnPR3转入农杆菌（C58C1pPMP90）中，在加有壮观霉素的LB平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混合液落至杯底，将电转化杯置于电转化仪（BIO-RAD）滑槽中，用1mm的点击杯和200欧姆，2.5Kv0.2cm的参数进行电击，点击后立即取出电转化杯，迅速加入0.5mLLB培养基，混匀，转移到1.5mL的离心管中；28℃，200rpm摇床培养3-5h；室温下，7500rpm离心1min，弃大部分上清，保留50μl将细胞重悬；将重悬后的农杆菌涂布于加有壮观霉素（Spe，50μgmL）的LB固体培养基上，28℃培养2天获得单菌落，挑取单菌落在20mL加有壮观霉素（Spe，50μgmL）的液体LB培养基上，28℃，180rmp摇床培养36小时后，用PnPR3基因的上下游引物作PCR检测，转化成功的菌落能扩增出1.0kp的条带（图5），经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。实验例4：农杆菌介导的植物遗传转化及转基因植物的筛选受体烟草种子经过NaClO表面消毒后，播种于12MS固体培养基（pH5.8）上，置于25℃恒温和持续光照（100μmolm2·s）的组培室培养4周，获得无菌苗，在组培室中培养。选取理想状态的烟草叶片作为外植体，在制备好的农杆菌菌液中浸染20min，吸干表面水分，将叶片平铺于MS1培养基上黑暗共培养2d（以第一个叶片肉眼看出菌体时所需的时间），将烟草叶片外植体转移至含筛选因子的芽诱导培养基如MS4上进行筛选（正面朝下），约15d继代一次。经转化的烟草叶片外植体，在继代培养基中光照培养，20~25天即可观察到叶片边缘长出愈伤组织或丛生芽，转入生根培养基MS（含抗生素Cef+Km），于25℃光照下诱导生根。挑选含有抗性的转基因烟草。采用CTAB法提取烟草的基因组：称取0.1g植物叶片置于1.5mL离心管中，加液氮研磨至粉状。加入900μl预热到65℃的2×CTAB缓冲液（Tris-HClpH7.5100mM，EDTA20mM，NaCl1.4M，CTAB2%），65℃水浴20min，中间每隔2min摇匀一次，取出冷却至室温，再加入500μl氯仿：异戊醇（24：1）混合液，旋转摇匀，4℃,7500rpm，离心10min，转移上清至一新的离心管，重复上述步骤；加入110体积3MpH5.2NaOAc和等体积的异丙醇，摇匀后4℃，12000rpm，离心20min，弃上清，用75％乙醇清洗两次后干燥，用含有RNase的1×TE缓冲液溶解并降解RNA，得到转基因烟草的基因组DNA，以该DNA为模板，以PnPR3基因的特异性引物进行PCR扩增，在获得的12株经抗生素筛选后疑似PnPR3转基因小苗中，检测出4株转基因植物（T4,T6,T9,T11），PCR产物条带单一，大小符合PnPR3序列片段长度（图6）。经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析。为了考察在含有基因的转基因烟草株系中PnPR3基因的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA，反转录成cDNA后用于RT-PCR分析，检测AtKUP1基因在转基因植物中的转录水平。采用TRIzoLReagent（RNA提取试剂，Invitrogen）提取RNA后，使用RevertAidTM-MμlVReverseTranscriptaseKit（反转录试剂盒，Fermentas）进行cDNA的合成，植物总RNA约0.1-0.5ug，Oligo（dT）50ng，10mMdNTPmix1μl，用DEPC处理水补足至9μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物11μl（5×reactionbuffer4μl，25mMMgCl24μl，0.1MDTT2μl，RNA酶抑制剂1μl），将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，然后42℃保温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用PnPR3基因上下游特异性引物作PCR，成功转入PnPR3的植株均能扩增出1.0kb的条带（图7），证明PnPR3基因可以在转基因植物中成功地转录。经RT-PCR确认的转基因植株用于进一步的生理生化分析。实验例4：过表达PnPR3基因对腐皮镰刀菌（Fusariumsolani）抗性试验。为了评价PnPR3转基因烟草的抗性水平，选择成功转入PnPR3基因的烟草品系（T4，T6，T9，T11）并切断转基因烟草和对照组的健康幼叶。在叶片上形成均匀大小的伤口，用无菌枪头接种200μL的F.solani孢子悬浮液（孢子浓度为1×105分生孢子ml）。将处理过的叶子置于无菌和湿润的滤纸上，并在28℃下在玻璃皿中共培养，观察叶子的发病情况。7天后，对照烟叶出现严重的黄化和轻微腐烂，而转基因烟草品系的叶片仅显示出轻微的黄化；收集叶片，通过从云南谋赞生物有限公司购买的几丁质酶试剂盒，使用分光光度法测定叶片中的几丁质酶活性。PnPR3在烟草中的过量表达可以通过提高几丁质酶活性增强转基因烟草对F.solani的抗性（图8）；分析接种F.solani真菌孢子的转基因烟草和对照叶片中的几丁质酶活性；在初始阶段，烟草叶中的几丁质酶活性水平维持在低水平，而转基因烟草叶由于PnPR3的过表达而获得比对照更高的几丁质酶活性。用F.solani孢子接种2天后，烟草叶片中几丁质酶活性显着增加，叶片中几丁质酶活性随时间累积。相关研究表明，高等植物通常不含几丁质，但当被细菌，真菌或病毒感染时，植物几丁质酶活性迅速增加，增强植物对病原微生物的抗性；因此，PnPR3是参与对三七抗根腐病感染的重要防御基因（图9）。序列表昆明理工大学三七病程相关蛋白PnPR3的基因及其应用4SIPOSequenceListing1.01918DNA三七Panaxnotoginseng1atgagattttggacagtaaccatattcattctagcctcataccttgcagtttctgcagaa60caatgtgggaaacaagctggaatggctttgtgcccaaatgggctctgttgcagccaattc120gggtggtgtggcagcacccctgagtactgcactaattgccaaagccagtgcagcgaacct180tccccaggtggaggtgttagctccataattactgagtctgtgtttaatcaaatgcttaaa240tatcgaaacgacggaaggtgccgtactaatggattctacacatacaatgcttttatcaat300gctgcaaaatctttcaatggttttgggacaactggtaatactgtccaacagaaacaagag360ctcgccgctttcttggctcagacctctcatgaaaccacaggtggatgggcaagtgcccca420gatggtcaatatgcatggggatattgctttataagagaaaacaaccaggctgcttactgc480acttccaaagactggccttgtcctcctggcaaactatactatggcagaggacctatccaa540ctcactcacaactacaactatgggcaagctggaaatgcaattggagtggacctaataaac600aaccctgacctagttgccacggacgctaccatatcattcaaaacagccatatggttctgg660atgactccacaggctaacaagccatcgagccacgatgtgattacacaaagatggtcaccc720tctgcagcagataccgcggctggtcgcgtccctggcttcggtgtcatcactaacataatt780aacggcgggctcgagtgtgatcacggcagggatgataaggcggaggataggattggattc840tacaagaggtattgtgacattctgcaagttggctatgggaatgaactcaattgcaacaat900caaaggccttttggctaa9182305PRT三七Panaxnotoginseng2MetArgPheTrpThrValThrIlePheIleLeuAlaSerTyrLeuAla151015ValSerAlaGluGlnCysGlyLysGlnAlaGlyMetAlaLeuCysPro202530AsnGlyLeuCysCysSerGlnPheGlyTrpCysGlySerThrProGlu354045TyrCysThrAsnCysGlnSerGlnCysSerGluProSerProGlyGly505560GlyValSerSerIleIleThrGluSerValPheAsnGlnMetLeuLys65707580TyrArgAsnAspGlyArgCysArgThrAsnGlyPheTyrThrTyrAsn859095AlaPheIleAsnAlaAlaLysSerPheAsnGlyPheGlyThrThrGly100105110AsnThrValGlnGlnLysGlnGluLeuAlaAlaPheLeuAlaGlnThr115120125SerHisGluThrThrGlyGlyTrpAlaSerAlaProAspGlyGlnTyr130135140AlaTrpGlyTyrCysPheIleArgGluAsnAsnGlnAlaAlaTyrCys145150155160ThrSerLysAspTrpProCysProProGlyLysLeuTyrTyrGlyArg165170175GlyProIleGlnLeuThrHisAsnTyrAsnTyrGlyGlnAlaGlyAsn180185190AlaIleGlyValAspLeuIleAsnAsnProAspLeuValAlaThrAsp195200205AlaThrIleSerPheLysThrAlaIleTrpPheTrpMetThrProGln210215220AlaAsnLysProSerSerHisAspValIleThrGlnArgTrpSerPro225230235240SerAlaAlaAspThrAlaAlaGlyArgValProGlyPheGlyValIle245250255ThrAsnIleIleAsnGlyGlyLeuGluCysAspHisGlyArgAspAsp260265270LysAlaGluAspArgIleGlyPheTyrLysArgTyrCysAspIleLeu275280285GlnValGlyTyrGlyAsnGluLeuAsnCysAsnAsnGlnArgProPhe290295300Gly305333DNA人工序列Artificial3ggatccatgagattttggacagtaaccatattc33435DNA人工序列Artificial4cagctgtagacctaaacctaaaccattaaatatgg35

权利要求：1.一种三七病程相关蛋白PnPR3的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，编码如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的蛋白质。2.权利要求1所述的三七病程相关蛋白PnPR3的基因在提高植物抗病性中的应用。

百度查询： 昆明理工大学 三七病程相关蛋白PnPR3的基因及其应用