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申请/专利权人：昆明理工大学

摘要：本发明公开了一种三七的病程相关蛋白1家族基因PnPR1‑2，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所述，编码如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的蛋白质，本发明通过功能基因组学相关技术研究证实PnPR1‑2基因具有提高植物抗真菌的功能，将本发明抗真菌PnPR1‑2基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，结果转基因烟草植株具有很强的体外抗真菌活性，超表达PnPR1‑2的转基因烟草对茄腐镰刀菌、轮枝镰刀菌、串珠状赤霉菌、人参链格孢等多种真菌的生长具有明显的抑制作用。

主权项：1.三七病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2在提高烟草对茄腐镰刀菌（Fusariumsolani）、轮枝镰刀菌（F.verticillioides）、串珠状赤霉菌（Gibberellamoniliformis）、人参链格孢菌（Alternariapanax）抗性中的应用，其中所述三七病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，编码如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

全文数据：一种三七病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2及应用技术领域本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种具有抗真菌活性的三七病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2及应用。背景技术植物病害是农业生产中一个非常棘手的问题，尤其是真菌病害，约占到植物总病害的80％，严重影响农作物的产量和品质。传统的病害防治方法取得了一定成效，一是依靠传统育种方法培育抗性品种，二是化学农药的使用，三是采取轮作等耕作制度。然而，这些方法都存在或多或少的弊端，如抗性品种培育的周期长、化学农药残留高且极易造成环境污染、耕作制度调整则费时费力，所以传统控制植物病害的方法均不能彻底解决问题。随着重组DNA技术的创立和发展，利用基因工程技术来培育抗病植物新品种已取得初步成效，且有望从根本上解决真菌病害问题。植物具有保护自身免受各种病原体侵害的防卫机制。在植物体受到病原体入侵时，植物通过迅速改变抗病相关基因表达来对病原菌和外部胁迫做出反应，诱导一些特殊蛋白的重新合成，如病程相关蛋白（pathogenesis-relatedproteins，PRs）。植物细胞在病原菌攻击后使病原的侵染局部化，并在侵染的部位形成坏死斑限制病原的扩展（LoonLCV,StrienEAV.Thefamiliesofpathogenesis-relatedproteins,theiractivities,andcomparativeanalysisofPR-1typeproteins.PhysiologicalandMolecularPlantPathology,1999,552:85-97）。PRs基因是植物防卫系统的重要组成部分，与超敏反应（hypersensitiveresponse，HR）及系统获得性抗性（systematicacquireresistance，SAR）密切相关，它的诱导表达常作为SAR建立的标志，同时其基因编码产物已成为近年来抗性研究的热点之一。PR1首先在被TMV侵染的烟草叶片中检测到，它与超敏反应及系统获得抗性密切相关。植物获得性系统抗性是指在同一植物上未感染部位出现的抗性，这种抗性在植物受到再次侵染时，不仅对与初次感染相同的病原物表现出抗性，而且往往对其他类型的病原物也起作用CarrJP,BeachyRN,KlessigDF.ArethePR1proteinsoftobaccoinvolvedingeneticallyengineeredresistancetoTMV?.Virology,1989,1692:470-473。经TMV感染后诱导的烟草系统获得抗性，不仅对TMV本身有作用，而且对其他的病原物如烟草枯斑病毒、真菌和细菌也有抵抗作用（郭金芳,潘俊松,王琛,赵智燕,何亚丽.病程相关蛋白与植物抗病性关系的研究及其在草坪草抗病育种中的应用.草业学报,2008,176:156-163）。植物的SAR可能包括多种机制，但是，烟草对真菌、细菌或病毒的共同反应都是产生PR1，并且在具有系统获得抗性的未感染的叶片上也出现PR1蛋白，这说明PR1和植物的SAR之间有紧密的联系。水杨酸（salicylicacid，SA）能通过诱导植物体中PR1基因的表达，提高植物的抗病性。在HR发生前，有一个短暂的氧爆发阶段，使细胞中活性氧的浓度明显提高。而活性氧可以直接杀伤病原物、参与膜脂过氧化、导致HR，而且能促进寄主细胞壁木质化，增强细胞壁的结构，诱导木质素的产生。同时H2O2是一种能自由扩散的小分子，可以跨过细胞膜进入病原物侵染以外的组织中，作为第二信使来激活防卫基因的表达，提高植物抗病性。SA是将病害和创伤的信息传递到植物其他部分的信号分子之一（MétrauxJP.Recentbreakthroughsinthestudyofsalicylicacidbiosynthesis.TrendsinPlantScience,2002,78:332-334）。SA是诱发PR1的信号分子，病菌侵染植物体后，活性氧瞬时达到高峰，寡糖素转化为水杨酸，通过胞内信号传递，PR1基因表达开始表达，产生菌类细胞壁水解酶（吴建丽,郝建军.水杨酸与植物诱导抗病性.辽宁林业科技,2005,1:33-35）。本发明的病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2来自三七（Panaxnotoginseng）。三七主产于云南文山州砚山县、马关、西畴、广南、麻栗坡、富宁、邱北等，另广西田阳、靖西、田东、德保等地也有种植。云南文山州三七历史悠久、产量大、质量好，为著名的道地药材。三七常年生长在阴蔽环境中，病害发生较为严重。三七上发生的病害主要的有根腐病、黑斑病、圆斑病、疫病、白粉病等，三七每年都因病害的大面积发生造成极为严重的损失。因此，加强三七抗病机制研究以及抗性基因克隆迫在眉睫。发明内容本发明的目的是提供一种从三七中克隆获得编码具有抗真菌活性的病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2，三七病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，该基因cDNA全长序列为852bp，包含一个501bp的开放阅读框、104bp的5’非翻译区、247bp的3’非翻译区，编码如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的蛋白质。本发明中PnPR1-2基因的编码区是序列表SEQIDNO：1中第105-605位所示的核苷酸序列。本发明分离三七的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，利用根癌农杆菌Agrobacteriumtumefaciens介导将目的基因转入受体植物中并过量表达，通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础，发明人将这个基因命名为PnPR1-2。PR1蛋白具有与体外抑菌活性，是植物受病原物侵染或非生物因子刺激后产生的一类水溶性蛋白。PR1蛋白通过攻击病原物、降解细胞壁大分子、降解病原物毒素等途径来提高植物对病原菌的抗性。本发明涉及分离包含PnPR1-2的DNA片段并鉴定其功能，其中所述DNA片段如序列表SEQIDNO：1所示，对该基因进行序列分析，发现PnPR1-2全长cDNA为852bp，包含一个501bp的开放阅读框ORF、104bp的5’非翻译区untranslatedregion，UTR、247bp的3’UTR，其中ORF编码一个具有166个氨基酸的蛋白质。通过NCBIBIastp进行同源性分析表明，PnPR1-2基因编码蛋白与葡萄（Vitishybridcultivar）、烟草（Nicotianasylvestris）PR1蛋白相似性分别为68%、63%。PnPR1-2基因编码一个由166个氨基酸残基组成的蛋白质，生物信息学分析结果显示PnPR1-2蛋白质分子质量约为18.1KD，等电点为9.16。超表达序列表SEQIDNO：1所示序列可以增强烟草对茄腐镰刀菌（Fusariumsolani）、轮枝镰刀菌（F.verticillioides）、串珠状赤霉菌（Gibberellamoniliformis）、人参链格孢菌（Alternariapanax）的抗性。上述PnPR1-2基因可以应用于提高烟草的抗真菌特性，具体操作如下：（1）采用扩增PnPR1-2的特异引物，从接种茄腐镰刀菌后的三七根中提取总RNA，以oligodT18为反转录引物，通过逆转录-聚合酶链式反应reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR扩增出PnPR1-2编码区，然后将其连接到pGEM-T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；（2）用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切pGEM-T-PnPR1-2，通过胶回收得到目的基因片段，用同样的内切酶酶切植物表达载体pCAMBIA2300s，胶回收获得所需载体大片段，再将所获得PnPR1-2基因片段与pCAMBIA2300s片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；（3）以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR以及RT-PCR检测得到真正的转基因植株，分析转基因植物蛋白对真菌生长的抑制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明中来自三七的PnPR1-2基因能增强植物对几种病原真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产作物、花卉、药用植物等提供方便，减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减少环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。附图说明图1是本发明PnPR1-2转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果示意图，图中：Marker为DL2000DNAMarker大连宝生物；阳性对照为质粒pGEM-T-PnPR1-2为模板的PCR结产物；WT为非转基因烟草野生型总DNA为模板PCR的产物；图2是本发明阳性PnPR1-2转基因烟草中PnPR1-2转录水平的表达分析结果图；图中：Marker是DL2000DNAMarker大连宝生物；WT是非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为模板的PCR产物；阳性对照是质粒pGEM-T-PnPR1-2为模板的PCR产物；图3是本发明PnPR1-2转基因烟草体外抑菌活性效果图；图中a、b、c、d分别是对茄腐镰刀菌、轮枝镰刀菌、串珠状赤霉菌、人参链格孢；WT为野生型烟草的总蛋白；CK为空白对照，即无蛋白对照用于提取蛋白的缓冲液。具体实施方式下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。实施例1：PnPR1-2全长基因克隆以及序列分析用茄腐镰刀菌接种一年生三七的根部，取接种后12h的根提取总RNA。采用逆转录酶M-MLVpromega以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5μgTotalRNA，依次加入50ngoligo（dT）、2μLdNTP（2.5mMeach）、DEPC水至反应体积为14.5μL；混匀后，70℃加热变性5min后迅速在冰上冷却5min，然后依次加入4μL5×First-standbuffer、0.5μLRNasin（200U）、1μLM-MLV（200U），混匀并短时离心，42℃温浴1.5h，取出后70℃加热10min，终止反应。cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因PnPR1-2，所用上下游引物序列分别为5’CTTGTTCTATAAATAATCTTCATTGC3’及5’ATATGGATGAGAATTGTGTAAAAAG3’。采用AdvantageTM2PCREnzyme（Clontech）扩增出目的基因；PCR反应条件：95℃1min；95℃30s，55℃30s，72℃40s，30个循环；72℃5min；反应体系（10μL）为1μLcDNA、1μL10×Advantage2PCRBuffer、0.5μL50×dNTPMix（10mMeach）、0.2μL正向引物（10μM）、0.2μL反向引物（10μM）、0.2μLAdvantage2PCRPolymeraseMix、6.9μLPCR-Gradewater；PCR结束后，取5μL用于琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性以及大小。所得到PCR产物只有一条DNA带，故直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pGEM-Tvector（Promega），反应体系和操作过程为：取1.5μLPCR产物，依次加入1μLpGEM-Tvector（50ngμL）和2.5μL2×LigationsolutionI，混匀后置于16℃过夜反应；采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中；使用含有氨苄青霉素（ampicillin，Amp）的LB固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增PnPR1-2的特异引物鉴定出多克隆位点插入PnPR1-2的克隆，将所鉴定的克隆进行测序，最终获得的PnPR1-2全长cDNA为852bp，通过NCBIORFfinder（http:www.ncbi.nlm.nih.govgorfgorf.html）分析发现其包含一个501bp的开放读码框（见序列表），PnPR1-2编码一个含166个氨基酸的蛋白质PnPR1-2，其蛋白质分子质量约为18.1kD，等电点pI约为9.16。其中包括7个酸性氨基酸D，E、19个碱性氨基酸K，R，H、72个疏水氨基酸和89个极性氨基酸。信号肽预测结果显示PnPR1-2蛋白第1至第22个氨基酸为信号肽。实施例2：植物超表达载体构建采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（上海生工）提取插入PnPR1-2的大肠杆菌质粒pGEM-T-PnPR1-2以及植物表达载体pCAMBIA2300s的质粒，取1μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶BamHI（TaKaRa）和EcoRI（TaKaRa）分别对质粒pGEM-T-PnPR1-2和pCAMBIA2300s进行双酶切（100μL体系），反应体系和操作过程为：取20μLpGEM-T-PnPR1-2和pCAMBIA2300s质粒，分别依次加入10μL10×Kbuffer、5μLBamHI、5μLEcoRI、60μLddH2O，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应；将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后分别对PnPR1-2片段和pCAMBIA2300s载体大片段进行胶回收，整个过程使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工）；取1μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，其余产物置于-20℃保存备用。利用T4DNALigase（TaKaRa），将回收的PnPR1-2DNA片段和pCAMBIA2300s载体片段连接起来，反应体系（20μL）和操作过程为：取10μLPnPR1-2DNA片段依次加入2μLpCAMBIA2300s载体DNA、2μL10×T4DNALigaseBuffer、1μLT4DNALigase、5μLddH2O，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50mgL卡那霉素（kanamycin，Km）的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增PnPR1-2的特异引物进行PCR，挑选出PnPR1-2与pCAMBIA2300s成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入甘油并置于-80℃保存备用。提取并纯化上述大肠杆菌中的pCAMBIA2300s-PnPR1-2质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300s-PnPR1-2转入根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取2μgpCAMBIA2300s-PnPR1-2质粒加入含有200μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5min，随后转入液氮中冷冻1min，然后迅速置于37℃水浴5min，之后立即冰浴2min，加入800μLLB液体培养基于28℃振荡培养4h。将活化后的农杆菌涂于含有50mgLKm的LB固体培养基上，28℃静止培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增PnPR1-2的特异性引物进行PCR，检测pCAMBIA2300s-PnPR1-2是否转入农杆菌中，对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选本实验的转基因受体是烟草，将烟草种子用75%的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1%的HgCl2浸泡8min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于12MS培养基上，28℃暗培养6d，发芽后转至光照培养箱（25℃，16hd光照），以后每月用12MS培养基继代一次。从-80℃冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300s-PnPR1-2质粒的农杆菌LBA4404菌种，接种于5mL含有50mgLKm和20mgL利福平的LB液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1mL浑浊的菌液至含有50mgLKm的LB固体培养基上，28℃培养48h；随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20mgL的乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28℃振荡培养2-3h以活化农杆菌。取烟草无菌苗叶片切成1cm2左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，浸染时间为15min，用无菌滤纸吸干叶盘表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行培养，烟草转化的共培养基为MS+0.02mgL6-BA+2.1mgLNAA+30gLsucrose+6gL琼脂，22℃无光条件下共培养2天。将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS+0.5mgL6-BA+0.1mgLNAA+30gLsucrose+6gL琼脂+50mgLKm+200mgL头孢霉素（cefotaximesodiumsalt，Cef）；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养（25℃，16hd光照，8hd黑暗），待烟草长出芽后用含有50mgLKm和200mgLCef的MS培养基继代培养，因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选，将烟草再生苗移至含有50mgLKm的MS培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗进行PCR检测。采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，将提取的基因组DNA取1μL通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以转基因植株的基因组DNA为模板用扩增PnPR1-2的特异引物进行PCR，PCR结束后，取8μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株，部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，PnPR1-2转基因烟草共筛选到41株阳性转基因植株。实施例4：转基因烟草中PnPR1-2的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析取阳性转基因单株以及非转基因烟草（野生型）的嫩叶提取总RNA，逆转录生成cDNA第一链，并以此为模板用扩增PnPR1-2的特异引物进行PCR，根据PCR结果分析各转基因单株中PnPR1-2转录水平的表达，总RNA提取以及RT-PCR的方法与实施例1中相同，PCR结束之后，取8μL用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到29个转基因单株中PnPR1-2在转录水平大量表达，这些单株的编号为1～29。将实验室保存的几种真菌接种于PDA固体培养基（200gL马铃薯，15gL琼脂，20gL葡萄糖）上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性，供试真菌共有6种：茄腐镰刀菌（Fusariumsolani）、轮枝镰刀菌（F.verticillioides）、串珠状赤霉菌（Gibberellamoniliformis）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）、葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）。为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作，首先取1g转基因烟草单株（编号分别为3、5、9、15）及野生型叶片放入研钵中，加入1mL蛋白提取液（1MNaCl，0.1M乙酸钠，1%PVP，pH6），充分研磨；转入1.5mL离心管中，混匀后4℃静置过夜，4℃离心30min（12,000gmin），取上清于新的1.5mL离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.2μgμL，然后分别取20μL滴于各真菌培养基的无菌滤纸上，在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照（提取蛋白所用的溶液），28℃培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价PnPR1-2转基因烟草的体外抗真菌活性，结果如图3所示，PnPR1-2转基因烟草蛋白对茄腐镰刀菌、轮枝镰刀菌、串珠状赤霉菌以及人参链格孢的生长具有很强的抑制作用。序列表昆明理工大学一种三七病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2及应用4PatentInversion3.31852DNAPanaxnotoginsengmRNA1..8525'UTR1..104CDS105..6053'UTR606..8521gaccatctattttttctctttcttgttctataaataatcttcattgcaacttagtccaat60aactcatcaataccacctttctccaataccaaaaaccccacaaaatggcattcaccaaaa120tttcactactcattttcttaagtaccattttccattcgtcccatgctcaaaactccccac180aagactacctcaacgcccacaacgccgcccgtgcccaagtccgcgttggaccaatgagat240gggacaccaccgtcgccgcctacgcacaaaactacgccaacacattgatttccagctgcc300gacttgtccactcgagcggcagcggctacggcgagaaccttgcctatggcttccctactt360taaccggcacggcggccgttgatttgtgggtaaaggaaaagccttattacgactatgact420caaactcttgtatagggggagtgtgtgggcattatacccaagtggtttggcagacctcga480accggctcggctgcggtagggcgaggtgtaacaatggtgggtatattgtttcttgcaatt540atgcaccgccgggtaacattattggaaggcgcccttatgttagatcattggtttcatcca600agtaattaattatatatatatatatgggtgcggatcaataacactaagttttatacaaaa660ctttttacacaattctcatccatatttatggtgcattccattccatgcaataaaaaatgt720aattttttttatatgtgatttgatacgtaagatgtatttgctatacaaatacaagtgtaa780gatttccggcttattgataaagtggttttaatatttatggttgtggaaaaaaaaaaaaaa840aaaaaaaaaaaa8522166PRTPanaxnotoginseng2MetAlaPheThrLysIleSerLeuLeuIlePheLeuSerThrIlePhe151015HisSerSerHisAlaGlnAsnSerProGlnAspTyrLeuAsnAlaHis202530AsnAlaAlaArgAlaGlnValArgValGlyProMetArgTrpAspThr354045ThrValAlaAlaTyrAlaGlnAsnTyrAlaAsnThrLeuIleSerSer505560CysArgLeuValHisSerSerGlySerGlyTyrGlyGluAsnLeuAla65707580TyrGlyPheProThrLeuThrGlyThrAlaAlaValAspLeuTrpVal859095LysGluLysProTyrTyrAspTyrAspSerAsnSerCysIleGlyGly100105110ValCysGlyHisTyrThrGlnValValTrpGlnThrSerAsnArgLeu115120125GlyCysGlyArgAlaArgCysAsnAsnGlyGlyTyrIleValSerCys130135140AsnTyrAlaProProGlyAsnIleIleGlyArgArgProTyrValArg145150155160SerLeuValSerSerLys165326DNA人工序列3cttgttctataaataatcttcattgc26425DNA人工序列4atatggatgagaattgtgtaaaaag25

权利要求：1.三七病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2在提高烟草对茄腐镰刀菌（Fusariumsolani）、轮枝镰刀菌（F.verticillioides）、串珠状赤霉菌（Gibberellamoniliformis）、人参链格孢菌（Alternariapanax）抗性中的应用，其中所述三七病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，编码如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

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