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申请/专利权人：武汉海吉力生物科技有限公司

摘要：本发明公开了用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物、探针及试剂盒，其中引物及探针包括突变上游ARMS引物PM1‑F，与D842V2525AT位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列，突变下游引物PW1‑R，与PDGFRA基因保守序列结合；5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针PW1‑P，能与扩增片段结合；以及5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针PW1‑B，能与D842V位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。本发明的引物及探针特异性高、灵敏度好，检测能力高达1％。由其制备的试剂盒检测结果准确易读，操作简单快速，适用范围广。

主权项：1.用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，其特征在于，包括用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针、外控引物和探针，以及内控引物和探针；用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针的核苷酸序列如下：突变上游ARMS引物PM1‑F：SEQ ID NO:1，突变下游引物PW1‑R：SEQ ID NO:2，检测探针PW1‑P：SEQ ID NO:3，阻断探针PW1‑B：SEQ ID NO:4；其中，检测探针核苷酸序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰，3’端标记有淬灭基团；外控引物和探针的核苷酸序列如下：外控上游引物PR‑F：SEQ ID NO:5，外控下游引物PR‑R：SEQ ID NO:6，外控检测探针PR‑P：SEQ ID NO:7，外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB；内控引物和探针的核苷酸序列如下：内控上游引物IC‑F：SEQ ID NO:8，内控下游引物IC‑R：SEQ ID NO:9，内控检测探针IC‑P：SEQ ID NO:10，内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE，3’端标记有BHQ1。

全文数据：用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物、探针及试剂盒技术领域本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物、探针及试剂盒。背景技术胃肠间质瘤gastrointestinalstromltumor，GIST是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，其发病率有逐年增高的趋势。主要发生于胃肠道、大网膜和肠系膜，占所有胃肠道肿瘤的0.2％，占胃肠道肉瘤的80％，C-kit受体又称CD117基因通常呈阳性表达。对绝大多数患者来说，基因突变是肿瘤形成的关键，其中CKIT基因突变占80-85％，PDGFRα突变占7％，野生型未检测到突变占10-15％。GIST患者手术切除后容易复发，中位复发时间约为2年，仅有10％的患者长期随访未见复发。血小板衍生生长因子受体Platelet-derivedGrowthFactorReceptors,PDGFR是一种调节细胞生长的跨膜蛋白，属于III型酪氨酸激酶家族，主要分布于平滑肌细胞，内皮组织细胞、成纤维细胞和胶质细胞。PDGFR在调节细胞增殖、分化和新血管形成等方面发挥重要调节作用。PDGFR通过与信号分子结合后形成受体配体复合物并活化PDGFR，进而激活磷脂酰肌醇及下游的RAS-MAPK和PIK3CA信号通路，通过各种信号转导通路将有丝分裂等信号传递入细胞核，诱导相应基因表达，进而调节肿瘤细胞的分裂和增殖。甲磺酸伊马替尼格列卫是一种分子靶向药物，用于治疗不能切除或发生转移的恶性胃肠道间质肿瘤，在GIST的治疗中取得了非常好的疗效。目前，对于术后复发或转移的GIST患者，如果存在高危因素或不能进行手术治疗，甲磺酸伊马替尼格列卫是标准的一线药物，当格列卫用药过程中不能耐受，或出现疾病广泛进展generalizedprogression时，二线药物应用苹果酸舒尼替尼索坦。有研究表明，携带有PDGFRA基因D842V突变的GIST患者对伊马替尼耐药。在一项对携带PDGFRA突变的GIST患者的生存结局进行报道的国际调查中，在D842V突变的31例可评估患者中无一例获得疾病应答imatinib，21例68％发生疾病进展。目前检测基因突变的方法主要有测序法、溶解曲线法和液相芯片法。直接测序的方法灵敏度低，检测灵敏度只有20-30％；实验操作复杂，检测效率低、样品易污染，通常要1-2天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量漏检及假阴性的发生。而不管是染料溶解曲线还是探针溶解曲线法，都无法有效区分同一位点的多种突变类型。液相芯片法操作过程复杂，且容易污染，假阳性率高。发明内容为了解决现有检测技术出现的灵敏度低、检测时间长、检测效率低、样本易污染、假阳性率高等问题，本发明提供了用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针，灵敏度高，特异性强，有效避免假阳性。本发明还提供了包括上述引物和探针的试剂盒，检测方便快速，操作简单，结果易读，适用范围广。本发明提供的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针，核苷酸序列如下：突变上游ARMS引物PM1-F：SEQIDNO:1，突变下游引物PW1-R：SEQIDNO:2，检测探针PW1-P：SEQIDNO:3，阻断探针PW1-B：SEQIDNO:4；其中，检测探针核苷酸序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰，3’端标记有淬灭基团。表1：PDGFRA基因D842V热点突变突变名称氨基酸变化碱基变化CosmicIDPM1D842V2525AT736上述引物和探针是针对表1中位点突变设计的特异性检测引物，其中，PM1-F为突变上游ARMS引物，与D842V2525AT位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；PW1-R为突变下游引物，与PDGFRA基因保守序列结合；PW1-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；PW1-B为5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与D842V位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。优选地，上述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB。MGBMinorGrooveBinder基团可与DNA螺旋小沟结合，进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性Tm值提高约10℃。相对于普通TaqMan探针，MGB探针序列可设计得更短，特异性更强。本发明提供的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，包括以上任一所述的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针。优选地，所述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，还包括外控引物和探针，核苷酸序列如下：外控上游引物PR-F：SEQIDNO:5，外控下游引物PR-R：SEQIDNO:6，外控检测探针PR-P：SEQIDNO:7，外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB。其中，PR-F和PR-R为外控上下游引物，扩增PDGFRA基因保守序列；PR-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合。优选地，所述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，还包括内控引物和探针，核苷酸序列如下：内控上游引物IC-F：SEQIDNO:8，内控下游引物IC-R：SEQIDNO:9，内控检测探针IC-P：SEQIDNO:10，内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE，3’端标记有BHQ1。其中，IC-F和IC-R为内控上下游引物，扩增matK基因保守序列；IC-P为5’端标记有JOE信号3’端标记BHQ1的检测探针，能与扩增片段结合。优选地，所述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，还包括阳性对照品和内控品，阳性对照品包括含有发生2525AT碱基变化的PDGFRA基因片段gi|568815594:54285801-54286200的阳性质粒，含有PDGFRA基因保守序列gi|568815594:54288901-54289300段碱基的外控质粒，含有matK基因保守序列gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒；内控品为含有matK基因保守序列gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。优选地，所述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，试剂盒中的反应体系分为两种：检测反应体系：包括用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针，内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH2O；质控反应体系：包括外控引物和探针，内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH2O；所述ABpremix为美国应用生物系统公司产品FastAdvancedMasterMix；所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液，缓冲液中含有Mg2+。本发明还提供上述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒的使用方法，是首先提取待检样品的基因组DNA，分别加入到检测反应体系和质控反应体系，进行荧光定量PCR反应；另外设置非模板对照和阳性对照，与待检样品的基因组DNA进行同样的操作；根据Ct值分析检测结果：首先需要满足JOE信号Ct值≤25，非模板对照的FAM信号不起线，阳性对照的FAM信号Ct值≤20；911.1为阴性；所述Ct检测为待检样品的基因组DNA在检测反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值，所述Ct质控为待检样品的基因组DNA在质控反应体系中进行荧光定量PCR获得的Ct值。优选地，上述用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒的使用方法中，荧光定量PCR反应的条件为：95℃10min；92℃15sec，58℃1min，共15个循环；92℃15sec，60℃1min，共30个循环；在60℃时收集信号。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1本发明采用了特异性突变引物和探针阻断技术，可以特异性的检测人类PDGFRA基因D842V突变。其中，特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列；在此基础上，阻断探针与野生型序列特异性结合，有效抑制了野生型的非特异性扩增，进一步提高体系的特异性水平，从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。2在本发明实时荧光PCR外控检测体系中，对目的基因保守区域进行PCR扩增。其FAM信号Ct值反映了待测样本基因组DNA的相关信息DNA质量、纯度及上样量。在本发明试剂盒的内控检测体系中，对非人类基因保守区进行PCR扩增。其JOE信号Ct值反应了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息PCR反应是否正常，操作过程是否准确。检测快速，且操作简单，结果易读。3本方法灵敏度高，可实现50拷贝突变基因的稳定检出；特异性好，20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增，检测能力高达1％。附图说明图1为实施例1中IC实验结果；图2为实施例1中非模板对照NTC实验结果；图3为实施例1中阳性对照STD实验结果；图4为实施例1中灵敏度实验结果；图5为实施例1中精密度实验结果；图6为实施例2阴性样本实验结果；图7为实施例2中阳性样本实验结果。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例11、突变检测引物及探针，质控引物及探针序列设计：根据NCBI数据库公布的PDGFRA基因NCBIReferenceSequence:NM_006206.4野生型序列，以18号外显子D842V突变位点见表1为参考，用PrimerPremier5和PrimerExpress3.0生物信息学软件设计特异性突变引物和探针见表2。以基因工程构建的突变质粒即PM1质粒，插入基因片段gi|568815594:54285801-54286200，且发生D842V碱基变化和野生型质粒插入基因片段gi|568815594:54285801-54286200为模板，建立了实时荧光PCR突变Mutation检测体系，实现对PDGFRA基因D842V突变位点的高灵敏度和高特异性检测。表2：用于人类PDGFRA基因D842V突变检测的特异性引物和探针组合SEQIDNO:名称序列5’→3’末端修饰1PM1-FCTGTGACTTTGTCCTGTCCAGAAT无2PW1-RAGCCTGACCAGTGAGGGAAGT无3PW1-PCTATGTGTCGAAAGGC5’端FAM，3’端MGB4PW1-BGGCCAGAGACATC5’端双脱氧修饰，3’端MGB根据NCBI数据库公布的PDGFRA基因NCBIReferenceSequence:NC_000004.1221号外显子保守序列，设计外控引物和探针见表3。以基因工程构建的外控质粒即PR质粒，插入基因片段gi|568815594:54288901-54289300为模板，建立了实时荧光PCR外控ExternalControl检测体系，对待测样本基因组DNA的质量和上样量进行质控。表3：用于PDGFRA基因突变检测样本质控的外控引物和探针组合SEQIDNO:名称序列5’→3’末端修饰5PR-FGTGGGTGGAAAGGTCTGGATAA无6PR-RGTGGAGCACCGCCATGAA无7PR-PCTGTGCTGTTCCGCA5’端FAM，3’端MGB根据NCBI数据库公布的matK基因NCBIReferenceSequence:NC_001666.2保守序列non-humanDNA，设计内控引物和探针见表4。以基因工程构建的内控质粒即IC质粒，插入基因片段gi|11994090:c2400-2001为模板，建立了实时荧光PCR内控InternalControl检测体系，对实时荧光PCR反应体系和实验操作过程进行质控。表4：用于PCR扩增反应内部质控的内控引物和探针组合SEQIDNO:名称序列5’→3’末端修饰8IC-FTCGTAAGGAATCAAATGCTGGAG无9IC-RCAACGGGTTTACTAATAGGATGCC无10IC-PTCGATACCACAGTCCTTGCAACTCCCC5’端JOE，3’端BHQ12、检测人类PDGFRA基因D842V突变的检测试剂盒组成表5：试剂盒组成成分名称成份PDGFRA-8联PCR反应条反应体系1～2每个反应体系独立一管PDGFRA-阳性对照含PM1和PR质粒各8.3×102拷贝μL；含IC质粒5×102拷贝μLIC-内控模板含IC质粒3×103拷贝μL各反应体系组成如下：表6：实时荧光PCR扩增反应体系组成注：ABpremix全称FastAdvancedMasterMix，购自美国应用生物系统公司；10×bufferMg2+Plus购自宝生物工程大连有限公司。PCR反应总体积25μL，含19μL的反应体系，1μL的IC模板和5μL的检测模板阳性对照、非模板对照、质粒模板或待测样本基因组DNA，IC模板和检测模板可预混。其中，反应体系1用于人类PDGFRA基因D842V突变的检测。体系包含用于突变目的序列扩增的特异性突变引物和探针组合见表2以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合见表4。反应体系2用于待测样本的质控。体系包含用于外控基因扩增的外控引物和探针组合见表3以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合见表4。3、本发明试剂盒同样适用于石蜡包埋的组织样本石蜡包埋样本的提取使用QIAampDNAFFPETissueKitCatNo.56404。按照说明书提取胃肠道间质瘤患者组织标本基因组DNA，操作步骤简述如下：取临床采集的石蜡包埋组织切片10μm，5～7片放入1.5mL的离心管中，加入1000μL的二甲苯，涡旋10sec，12000rpm室温离心5min,弃上清注意不要倒掉沉淀；加入1000μL无水乙醇，以除去残留的二甲苯，涡旋混匀，12000rpm室温离心5min，弃上清；打开离心管盖，在37℃孵育10～15min，直至乙醇完全蒸发；分别加入180μLbufferATL和20μL蛋白酶K，涡旋混匀，56℃孵育2h左右，直到该组织完全溶解在孵育过程中可以轻弹重悬，有利与提高提取量；加入200μLbufferAL，涡旋混匀后加入200μL无水乙醇，再次涡旋震荡；将最后的混合物加入到离心柱上，8000rpm离心1min，弃废液；加入500μLbufferAW1，8000rpm离心1min，弃废液；加入500μLbufferAW2，12000rpm离心3min，弃废液；12000rpm离心1min；将离心柱放置在新的1.5ml离心管中，加入50～100μLbufferAE，室温放置5min，12000rpm离心1min，收集滤液，-20℃保存。将抽提好的DNA样本，用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量，DNA的浓度要求≥10ngμL，DNA的质量OD260280在1.8～2.0之间。定量后，母液-20℃保存。荧光定量PCR检测方法和结果判断同上所述。其他形式的样本可以根据需要采用现有常规的提取手段获得DNA。4、实时荧光PCR扩增反应体系设置：用2孔实时荧光PCR扩增反应进行PDGFRA基因D842V突变的检测。其中，反应体系1见表6包含实时荧光PCR突变检测体系和实时荧光PCR内控检测体系，反应体系2见表4包含实时荧光PCR外控检测体系和实时荧光PCR内控检测体系。实时荧光PCR扩增反应基本原理：上述检测探针序列5’端连接荧光基团FAM、JOE，3’端连接淬灭基团MGB、BHQ1。未进行PCR扩增反应前，检测探针5’端荧光基团与3’端的淬灭基团相互靠近，由于荧光共振能量转移的作用，荧光基团不能发出荧光。随着PCR扩增反应的进行，检测探针在DNA聚合酶的作用下发生水解，5’端荧光基团脱落而与淬灭基团相互分离，进而能发出荧光。通过仪器检测荧光信号的积累可反映待测模板目的片段的起始浓度。在突变检测探针、外控检测探针和阻断探针的3’端连接有MGBMinorGrooveBinder基团。MGB基团可与DNA螺旋小沟结合，进而提高MGB探针与对应模板的杂交稳定性Tm值提高约10℃。相对于普通TaqMan探针，MGB探针序列可设计得更短，特异性更强。该试剂盒的优势：1在本发明实时荧光PCR突变检测体系中，对目的基因突变区域进行PCR扩增。其中，特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列；在此基础上，阻断探针与野生型序列特异性结合，有效抑制了野生型的非特异性扩增，进一步提高体系的特异性水平，从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。2在本发明实时荧光PCR外控检测体系中，对目的基因保守区域进行PCR扩增。其FAM信号Ct值反映了待测样本基因组DNA的相关信息DNA质量、纯度及上样量。3在本发明实时荧光PCR内控检测体系中，对非人类基因保守区进行PCR扩增。其JOE信号Ct值反应了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息PCR反应是否正常，操作过程是否准确。5、实时荧光PCR扩增反应：将样本的基因组DNA用TE10mmolL，pH8.0稀释到2～10ngμL作为模板，加入到实时荧光PCR扩增反应体系中见表6进行扩增。实时荧光PCR扩增反应条件设置：表7：实时荧光PCR扩增反应条件最优的，在Stage2阶段15个循环，58℃的退火延伸温度，有利于突变模板的富集。在Stage3阶段30个循环，60℃的退火延伸温度可以保证更好的扩增特异性。6、检测结果分析根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果：以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成功的判定标准JOE信号Ct值≤25，扩增正常，以非模板对照NTC和阳性对照STDFAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准非模板对照FAM信号不起线，阳性对照FAM信号Ct值≤20，体系性能良好，结果有效；以质控检测孔FAM信号Ct值作为上样量质控标准918或无扩增曲线，说明加入的基因组DNA浓度过低或存在降解，建议重新提取该样本基因组DNA后进行检测；以待测样本突变检测孔与质控检测孔FAM信号的△Ct值△Ct＝Ct检测-Ct质控作为阴阳性判定标准△Ct≤11.1为阳性，△Ct11.1为阴性。7、用本发明的人类PDGFRA基因D842V突变检测试剂盒进行性能分析实验。每次检测需同时进行非模板对照NTC实验和阳性对照STD实验。图1为IC检测结果，Ct质控≤25，符合要求；图2为NTC检测结果，反应体系1～2FAM均不起线，符合要求；图3为STD检测结果，反应体系1～2FAM信号均起线且Ct≤20，符合要求。1灵敏度实验将以现有基因工程技术合成的含有PDGFRA基因D842V突变序列的质粒DNA干粉用TE10mmolL，pH8.0复溶，定量后稀释。取1×103拷贝μL突变质粒DNA分别进行10倍稀释，稀释2个梯度，然后以3种浓度梯度1×103拷贝μL、1×102拷贝μL和1×101拷贝μL的突变质粒DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增反应见图4。由图4可见本发明的荧光PCR方法灵敏度高，10拷贝μL突变基因即可检出。2精密度实验将以现有基因工程技术合成的含有PDGFRA基因D842V突变序列的质粒DNA干粉用TE10mmolL，pH8.0复溶，定量后稀释。以5×101拷贝μL突变质粒DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增反应见图5。由图5可见本发明的实时荧光PCR扩增反应重复性好20次重复实验结果稳定，CV11.1为阴性。图6中，Ct质控＝12.3，符合要求；突变检测孔FAM信号均未起线，显示样本检测结果为阴性。图7中，Ct质控＝12.0，符合要求；PM1突变检测孔FAM信号起线，且Ct质控PM1＝17.9，△Ct＝5.9，显示样本检测结果为PM1D842V阳性。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。SEQUENCELISTING武汉海吉力生物科技有限公司用于检测人类pdgfra基因d842v突变的引物、探针及试剂盒10PatentInversion3.3124DNA人工序列1ctgtgactttgtcctgtccagaat24221DNA人工序列2agcctgaccagtgagggaagt21316DNA人工序列3ctatgtgtcgaaaggc16413DNA人工序列4ggccagagacatc13522DNA人工序列5gtgggtggaaaggtctggataa22618DNA人工序列6gtggagcaccgccatgaa18715DNA人工序列7ctgtgctgttccgca15823DNA人工序列8tcgtaaggaatcaaatgctggag23924DNA人工序列9caacgggtttactaataggatgcc241027DNA人工序列10tcgataccacagtccttgcaactcccc27

权利要求：1.用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，其特征在于，包括用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针、外控引物和探针，以及内控引物和探针；用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针的核苷酸序列如下：突变上游ARMS引物PM1-F：SEQIDNO:1，突变下游引物PW1-R：SEQIDNO:2，检测探针PW1-P：SEQIDNO:3，阻断探针PW1-B：SEQIDNO:4；其中，检测探针核苷酸序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；阻断探针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰，3’端标记有淬灭基团；外控引物和探针的核苷酸序列如下：外控上游引物PR-F：SEQIDNO:5，外控下游引物PR-R：SEQIDNO:6，外控检测探针PR-P：SEQIDNO:7，外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB；内控引物和探针的核苷酸序列如下：内控上游引物IC-F：SEQIDNO:8，内控下游引物IC-R：SEQIDNO:9，内控检测探针IC-P：SEQIDNO:10，内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE，3’端标记有BHQ1。2.根据权利要求1所述的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB。3.根据权利要求1所述的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和内控品，阳性对照品包括含有发生2525AT碱基变化的PDGFRA基因片段gi|568815594:54285801-54286200的阳性质粒，含有PDGFRA基因保守序列gi|568815594:54288901-54289300段碱基的外控质粒，含有matK基因保守序列gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒；内控品为含有matK基因保守序列gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。4.根据权利要求1所述的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的试剂盒，其特征在于，试剂盒中的反应体系分为两种：检测反应体系：包括用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针，内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH2O；质控反应体系：包括外控引物和探针，内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH2O；所述ABpremix为美国应用生物系统公司产品FastAdvancedMasterMix；所述10×buffer为10倍浓度的缓冲液，缓冲液中含有Mg2+。

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