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申请/专利权人：中国农业大学

摘要：本发明涉及拟斯卑尔脱山羊草NAM‑S1基因及其分子标记和应用。本发明提供的来源于拟斯卑尔脱山羊草6号染色体的NAM‑S1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。基因NAM‑S1在小麦籽粒蛋白质积累方面发挥重要作用。基因NAM‑S1与抗白粉病基因Pm12之间的遗传距离为7.3cM，NAM‑S1基因在高蛋白质小麦新品种培育中具有潜在的应用价值。另外，本发明还提供用于特异检测NAM‑S1基因的分子标记CauNAM‑S1及其应用，该标记能够特异检测小麦品种中是否存在NAM‑S1基因，还可以检测小麦材料中是否含有抗白粉病基因Pm12，可同时用作小麦高蛋白和抗白粉病筛选的分子标记。

主权项：1.拟斯卑尔脱山羊草NAM‑S1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

全文数据：拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因及其分子标记和应用技术领域本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因及其分子标记和应用。背景技术小麦目前是全球第一大粮食作物，全世界约有35％～40％的人口将其作为主要的食物来源，约占全球卡路里消费总量的20％，全球小麦年产量7亿吨左右，提供约7000万吨的蛋白质。因此，增加小麦籽粒的蛋白含量不仅能够改良小麦的品质，而且有助于大幅度提高食用蛋白质的总量。小麦籽粒蛋白含量grainproteinconcentration，GPC及其组成决定着小麦的加工品质和营养品质。小麦的籽粒蛋白含量是典型的数量性状，而且容易受到环境条件的影响Groosetal.,2003。2006年，Uauy等通过图位克隆获得了控制蛋白含量的基因NAM-B1，该基因位于小麦6BS染色体上，编码一种NAC转录因子Uauyetal.,2006。拟斯卑尔脱山羊草含有抗病、优质及其他有用的基因，这些优良基因在改良小麦时容易利用。拟斯卑尔脱山羊草Aegilopsspeltoides的S基因组与普通小麦的B基因组在进化上具有较近的亲缘关系，故推测在拟斯卑尔脱山羊草的6SS上也应该有一个控制籽粒高蛋白含量的基因。白粉病是一种严重影响小麦产量和品质的世界性病害，在各国小麦产区均有发生。近二十年来，小麦白粉病发生的范围和面积不断扩大，危害程度日益加重，目前，小麦白粉病已成为影响小麦产量的重要限制因素。小麦白粉病的病原菌为禾本科布氏白粉菌小麦专化型，属子囊菌亚门真菌，该病菌具有多个生理小种，在不同地理生态环境中与寄主互作过程中变异速度快，目前一些大面积生产应用的品种已经或正在丧失抗性，因此白粉病害处于随时大面积流行的严重态势。农药防治对防控白粉病起到了一定的作用，但是会耗费大量的人力和财力资源，不利用生态环境。利用现代生物技术，不断鉴定和挖掘小麦中的抗白粉病基因或QTL位点，将抗白粉病基因或QTL位点通过分子基因工程或分子标记辅助选择培育和推广抗病品种，是防治小麦白粉病最为安全、经济和有效的途径。小麦抗白粉病基因Pm12也位于小麦-拟斯卑尔脱山羊草易位系6SS·6BL的6SS上。目前为止，在现有文献中尚没有小麦-拟斯卑尔脱山羊草易位系中控制籽粒高蛋白含量的基因报道，也不清楚抗白粉病基因Pm12与高蛋白含量基因的遗传距离。发明内容本发明的目的是提供拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因，以及NAM-S1基因在增加小麦籽粒蛋白质含量中的作用，并且证明在小麦-拟斯卑尔脱山羊草易位系中该基因与抗白粉病基因Pm12之间的遗传距离。本发明的另一目的是提供拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因分子标记CauNAM-S1及其应用，利用该标记特异检测小麦品种中是否存在NAM-S1基因，还用于检测小麦材料中是否含有抗白粉病基因Pm12，同时用作小麦高蛋白和抗白粉病筛选的分子标记。为了实现本发明目的，本发明提供的拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因，其为控制小麦籽粒蛋白质含量的基因，利用该基因可提高小麦籽粒的蛋白含量。拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的核苷酸序列为：iSEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或iiSEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv与i、ii或iii的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。本发明还提供由上述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明还提供含有所述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。本发明还提供所述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因，含有所述NAM-S1基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在提高作物蛋白含量中的应用。本发明中涉及的作物包括但不限于小麦、大麦、黑麦、燕麦、拟斯卑尔脱山羊草。携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中Weissbach，1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，PlantMolecularBiology，2ndEdition。例如，可将含有所述NAM-S1基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系通过农杆菌介导、花粉管导入或基因枪的方法转入作物中，培育高籽粒蛋白含量的转基因作物。本发明还提供所述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的分子标记CauNAM-S1，用于特异性PCR扩增该分子标记的引物为：正向引物F5'-ACCGCAGACGATGCCGGCT-3'和反向引物R5'-TCAGGGATTCCAGTTCACG-3'。本发明还提供所述分子标记CauNAM-S1在检测作物中NAM-S1基因和或Pm12基因中的应用，本发明还提供所述分子标记CauNAM-S1在小麦高蛋白含量和或抗白粉病的分子标记辅助育种中的应用。本发明还提供所述分子标记CauNAM-S1在筛选和鉴定兼具高蛋白含量和抗白粉病的小麦新品种中的应用。本发明还提供用于检测作物中NAM-S1基因和或Pm12基因的引物，包括正向引物F5'-ACCGCAGACGATGCCGGCT-3'和反向引物R5'-TCAGGGATTCCAGTTCACG-3'。本发明进一步提供含有所述引物F和R的检测试剂盒。本发明从拟斯卑尔脱山羊草中克隆得到一个小麦NAM家族基因，命名为NAM-S1，NAM-S1基因全长1547bp，由3个外显子和2个内含子组成，其开放阅读框全长1227bp，编码408个氨基酸，预测其分子量为43.6kDa，等电点为9.007。在小麦-拟斯卑尔脱山羊草6SS·6BL易位系中NAM-S1基因替换NAM-B1后提高了籽粒蛋白的含量。根据NAM-S1基因序列，开发出特异检测NAM-S1基因的分子标记CauNAM-S1，在6SS·6BL易位系的分离群体中证明该标记和小麦抗白粉病基因Pm12之间的遗传距离为7.3cM。因此，利用CauNAM-S1标记和抗白粉病基因Pm12的分子标记同时进行筛选，能够获得兼具高蛋白和抗白粉病的小麦新品种。本发明具有以下优点：一小麦是世界上最重要的粮食作物之一，全球小麦年产量约7亿吨，如果小麦籽粒蛋白含量增加1％，相当于全球小麦蛋白含量增加700万吨。与普通小麦6BS染色体的NAM-B1基因相比，本发明的NAM-S1基因大幅度提高了小麦籽粒蛋白质含量，因此，NAM-S1基因对于增加全球的食用蛋白质供应具有重要意义。二本发明提供了特异检测NAM-S1基因的分子标记CauNAM-S1标记，该标记是基于琼脂糖电泳的标记，方法较为简单，可使用新型的核酸染料进行染色，更加安全、实用。对于充分利用NAM-S1基因，促进小麦分子育种具有重要意义。三本发明提供的CauNAM-S1标记可同时检测控制小麦籽粒蛋白含量的基因NAM-S1和抗白粉病基因Pm12，即一个标记同时选择两种性状，对于提高小麦分子育种的效率，实现多性状的聚合育种具有重要的意义。附图说明图1为本发明实施例1中对克隆获得的拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的电泳检测结果以及基因结构分析结果；其中，a:克隆的NAM-S1基因的电泳检测结果，b:NAM-S1基因结构分析；1-4分别为基因组DNA、1kbDNAmarker，DL2000DNAmarker，cDNA。图2为本发明实施例2中构建的拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的系统进化树。图3为本发明实施例3中分子标记CauNAM-S1在10抗和10感材料中的扩增结果；其中，S1-S10代表感白粉病小麦材料，R1-R10代表抗白粉病小麦材料。图4为本发明实施例3中NAM-S1基因的分子标记连锁图谱；其中，左侧标注的数值表示相邻位点之间的遗传距离单位，cM。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件；所用原料均为市售商品。实施例1拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的克隆根据NCBI上公布的NAM-A1DQ869672、NAM-D1DQ869675、NAM-B1DQ869673、NAM-B2DQ869676、NAM-D2DQ869677基因的序列信息，设计扩增NAM-S1基因的引物NAMS1ORF1，用高保真酶PCR扩增后获得NAM-S1基因完整的基因组和cDNA序列。PCR反应体系为：模板DNA3ul，正、反向引物各1ul，dNTP10mM0.4ul，高保真TaqDNA聚合酶5Uμl0.2ul，10×PCR反应缓冲液2ul，加ddH2O补足20ul后混匀。PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，共33个循环；72℃7min，16℃结束反应。PCR反应结束后，以1％琼脂糖电泳检测扩增结果。电泳结果表明，NAM-S1基因组DNA和cDNA的大小分别为1.5kb图1a中泳道1和1.2kb图1a中泳道4左右。表1引物序列信息实施例2拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的遗传进化分析从NCBIGenBank下载其他物种的NAM家族基因，利用MEGA6.0软件绘制了拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的编码蛋白与其他物种中同源NAM基因的编码蛋白的系统进化树。结果显示图2，不同来源的NAM蛋白分成了4类Group。其中NAM-S1属于GroupII，此外还包括了NAM-B16B染色体、NAM-B22B染色体和NAM-A16A染色体、NAM-D22D染色体和AetNAM-D16D染色体，大麦的HvNAM-1和HvNAM-2H基因组，提莫非维小麦的NAM-GG基因组。进一步可将GroupII分为两个亚类，两个亚类分别是来源于小麦第六和第二同源群的部分NAM蛋白，其中来自第六同源群的HvNAM-1、NAM-B1、NAM-A1、NAM-D1、NAM-V1和NAM-G1位于第一个亚类SubgroupI，来自第二同源群的NAM-B2、NAM-D2和HvNAM-2位于第二个亚类SubgroupII。进化树中NAM-S1蛋白与来源于小麦第六同源群的部分NAM蛋白同被分在第一个亚类，表明NAM-S1基因来源于拟斯卑尔脱山羊草的6号染色体。在GroupII中，来源于普通六倍体小麦中的NAM-A1、NAM-B1、NAM-B2、NAM-D1、NAM-D2均已经被证明具有加速衰老，提高籽粒中蛋白质、铁、锌的含量的生物学功能。从进化树来看，来源于拟斯卑尔脱山羊草的NAM-S1基因与已知功能的基因同被分为一个类群图2，可以推测NAM-S1基因可能也具有相关的功能，即加速衰老，提高籽粒中蛋白质、铁、锌的含量。实施例3拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因分子标记开发根据以上序列比对结果，设计出用于特异检测NAM-S1基因的标记CauNAM-S1，用于特异性PCR扩增标记CauNAM-S1的引物见表1。挑选小麦抗白粉病基因Pm12F2分离群体中10个抗病和10个感病后代，进行了NAM-S1基因的分子标记检测。结果如图3所示，该结果表明，NAM-S1基因和Pm12基因遗传距离较近，在F2分离群体中NAM-S1基因和Pm12基因发生了交换。为了确定NAM-S1和Pm12基因的遗传距离，本发明利用CauNAM-S1在Pm12的F2n＝430分离群体中进行检测。用MapmakerEXP3.0软件计算标记与抗病基因之间的遗传距离，LOD值为3.0。利用MapdrawV2.1软件整合了barc1169、cau127、barc198、Pm12和wmc105分子标记，绘制了NAM-S1基因的遗传连锁图谱图4。结果显示，与NAM-S1基因最近的标记为wmc105，其次为Pm12，其中NAM-S1基因与Pm12之间的遗传距离为7.3cM。实施例4利用分子标记CauNAM-S1检测不同小麦材料中的NAM-S1基因对总共6个Pm12的F2：3家系的70单株进行了籽粒蛋白质含量GPC的测定和抗白粉病鉴定，并通过分子标记筛选确定了Pm12的带型，结果如表2所示。表2Pm12分离群体GPC统计对每个F2:3家系材料进行抗病性鉴定后，分别统计抗病、感病和杂合单株的平均蛋白质含量，统计结果如表3所示，抗病、感病和杂合单株的平均GPC分别是20.54％、17.56％和19.97％，统计结果显示，抗病材料的平均GPC含量要高于杂合和感病材料，根据NAM-S1和Pm12基因的遗传距离，初步推测NAM-S1是有功能的基因。在6SS·6BL易位系中，NAM-S1基因的导入会提高6SS·6BL易位系材料的GPC含量。表3Pm12分离群体GPC统计虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。参考文献1、Groos,C.,Robert,N.,Bervas,E.andCharmet,G.2003Geneticanalysisofgrainprotein-content,grainyieldandthousand-kernelweightinbreadwheat.TheorApplGenet,106,1032-1040.2、Cao,A.,Xing,L.,Wang,X.,Yang,X.,Wang,W.,Sun,Y.,Qian,C.,Ni,J.,Chen,Y.andLiu,D.2011SerinethreoninekinasegeneStpk-V,akeymemberofpowderymildewresistancegenePm21,conferspowderymildewresistanceinwheat.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,108,7727-7732.3、Uauy,C.,Distelfeld,A.,Fahima,T.,Blechl,A.andDubcovsky,J.2006ANACGeneRegulatingSenescenceImprovesGrainProtein,Zinc,andIronContentinWheat.Science,314,1298-1301.4、A.2006ThegenusDasypyrum––part1.ThetaxonomyandrelationshipswithinDasypyrumandwithTriticeaespecies.Euphytica,152,429-440.5、Blanco,A.,Resta,P.,Simeone,R.,Parmar,S.,Shewry,P.R.,Sabelli,P.andLafiandra,D.1991ChromosomallocationofseedstorageproteingenesinthegenomeofDasypyrumvillosumL.Candargy.TheoreticalandAppliedGenetics,82,358-362.6、Ma,J.,Zhou,R.,Dong,Y.,Wang,L.,Wang,X.andJia,J.2001MolecularmappinganddetectionoftheyellowrustresistancegeneYr26inwheattransferredfromTriticumturgidumL.usingmicrosatellitemarkers.Euphytica,120,219-226.

权利要求：1.拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.由权利要求1所述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3.含有权利要求1所述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的表达盒、重组载体或重组菌。4.权利要求1所述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因，或权利要求3所述表达盒、重组载体或重组菌在提高作物蛋白含量中的应用，所述作物为拟斯卑尔脱山羊草或小麦-拟斯卑尔脱山羊草易位系。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将权利要求3所述的表达盒、重组载体或重组菌，通过农杆菌介导、花粉管导入或基因枪的方法转入作物中，培育高籽粒蛋白含量的转基因作物。6.用于检测权利要求1所述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的分子标记CauNAM-S1的引物，其特征在于，包括正向引物F5'-ACCGCAGACGATGCCGGCT-3'和反向引物R5'-TCAGGGATTCCAGTTCACG-3'。7.权利要求6所述引物在检测作物中NAM-S1基因和或小麦抗白粉病基因Pm12中的应用，所述作物为拟斯卑尔脱山羊草或小麦-拟斯卑尔脱山羊草易位系。8.权利要求6所述引物在小麦高蛋白含量和或抗白粉病的分子标记辅助育种中的应用。9.权利要求6所述引物在筛选或鉴定高蛋白含量和或抗白粉病小麦品种中的应用。

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