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申请/专利权人：东莞博奥木华基因科技有限公司

摘要：本发明公开了一种基于半导体测序的PKU致病基因突变检测方法及装置。本发明通过构建本地突变数据库，全面反映检测范围内可能存在的背景噪音，能有效区分突变的真假阳性，解决了半导体测序平台固有的均聚碱基测序错误导致PKU检测背景噪音大的问题，并且可以较好控制不同批次测序质量的影响，提高了检测的准确性和稳定性，尤其适用于Proton平台。

主权项：1.基于半导体测序的苯丙酮尿症致病基因突变检测方法，所述方法用于非疾病诊断目的，包括如下步骤：S1：针对苯丙酮尿症致病基因构建用于半导体测序的扩增子文库，将待测样本的扩增子文库上机测序，获得测序序列；S2：将测序序列与人类基因组参考序列进行序列比对，根据比对结果进行质控过滤；S3：将质控过滤后的测序序列进行变异分析，获取原始变异检测结果；S4：使用本地突变数据库对待测样本的原始变异检测结果进行校正；其中，本地突变数据库的构建方法包括：汇集至少30个阴性对照样本的原始变异检测结果，统计各位置上各类型变异的出现次数、变异频率，变异深度，相关参数的中位值和标准差，形成本地突变数据库；构建本地突变数据库时，统计深度＞20X的变异；需要进行校正的原始变异检测结果包括：变异频率在0.15～0.4的碱基替换变异和单碱基插入缺失变异；校正的方法包括：以正态分布作为模型，通过计算偏离度Z值，如果Z值≤2.5，则将待测样本在该位置上的该变异剔除；其中，Z值＝待测样本变异频率‑本地突变数据库对应变异频率中位值本地突变数据库对应变异频率标准差；S5：对校正后的所有变异检测结果进行格式转换和变异注释，并参照人群频率数据库进行过滤，确定最终突变检测结果；参照人群频率数据库进行过滤的方法包括：如果在本地突变数据库中该变异的变异频率大于30％，而在人群频率数据库中所述变异的变异频率小于5％，则检验其Z值；如果Z值小于3，则作为假阳性突变过滤。

全文数据：基于半导体测序的PKU致病基因突变检测方法及装置技术领域本发明属于生物信息学领域，具体涉及一种基于半导体测序的PKU致病基因突变检测方法及装置。背景技术苯丙酮尿症Phenylketonuria，PKU是由于缺乏苯丙氨酸羟化酶phenylalaninehydroxylase，PAH所致的一种氨基酸代谢异常的疾病。PKU患儿出生时正常，通常3～6个月时开始出现症状，临床表现通常为智力发育落后，发色由黑变黄，尿和汗液中排出较多苯乙酸，可有明显鼠尿臭味。该病目前尚无有效的根治办法，仅能通过食疗减轻和控制患者的症状，因此，快速、准确的致病基因检测、携带者的检出及遗传咨询是预防本病的关键。PKU属于常染色体隐性遗传病，根据不同病因，在分子水平上可将PKU分为苯丙氨酸羟化酶phenylalaninehydroxylase，PAH缺乏型PKU和四氢生物蝶呤tetrahydrobiopterin，BH4缺乏型PKU，其中PAH缺乏型PKU占了98％～99％，都是由于PAH基因发生突变，主要包括点突变以及重复缺失突变；BH4缺乏型PKU则是由于PAH的辅助因子BH4缺乏造成，主要是由于6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶PTS、鸟苷三磷酸环化水合酶GCH1、二氢生物蝶呤还原酶QDPR和蝶呤-4-甲醇胺脱水酶PCBD1这四个基因突变所致，此外，Sepiapterin还原酶SPR是属于醛-酮还原酶的一组酶，催化BH4生物合成的最终步骤，其突变也会导致PKU。常见的PKU检测技术包括PCR及其衍生技术、短串联重复序列技术STR以及基因测序技术；此三种方法相比，PCR及其衍生技术的可重复性及准确性均有不足，不能明确碱基变异的具体位置与形式，也不能区分基因的多态和突变位点；STR方法虽经济快速，但其仅适用于STR可提供连锁信息的家庭；而测序技术不仅能检测出已知突变位点，还能发现新发突变位点。因此，将基因测序技术应用于PKU检测更快捷，准确。然而，当前半导体测序容易出现均聚碱基的测序错误，用于检测PKU致病基因变异时会产生较大的背景噪音，此外，PKU致病基因文库构建时必须要使用DMSO，其影响了PCR扩增的保真效率，从而加大了背景噪音，再者，基于半导体测序的PKU致病基因实际检测中，不同批次质量不稳定，以上原因均使得PKU致病基因突变检测准确率低，难以有效区分突变的假阴性。因此，开发一种准确率高的基于半导体测序的PKU致病基因突变检测方法及装置，非常有现实意义。发明内容本发明的目的在于提供一种基于半导体测序的PKU致病基因突变检测方法及装置。本发明所采取的技术方案是：基于半导体测序的苯丙酮尿症致病基因突变检测方法，包括如下步骤：S1：针对苯丙酮尿症致病基因构建用于半导体测序的扩增子文库，将待测样本的扩增子文库上机测序，获得测序序列；S2：将测序序列与人类基因组参考序列进行序列比对，根据比对结果进行质控过滤；S3：将质控过滤后的测序序列进行变异分析，获取原始变异检测结果；S4：使用本地突变数据库对待测样本的原始变异检测结果进行校正；S5：对校正后的所有变异检测结果进行格式转换和变异注释，并参照人群频率数据库进行过滤，确定最终突变检测结果。作为上述方法的优选，步骤S2中，所述根据比对结果进行质控过滤包括：去除低质量的、多匹配和非完全匹配到染色体上的测序序列，并剔除长度在扩增子片段长度范围以外的测序序列。作为上述方法的优选，本地突变数据库的构建方法包括：汇集至少30个阴性对照样本的原始变异检测结果，统计各位置上各类型变异的出现次数、变异频率，变异深度，相关参数的中位值和标准差，形成本地突变数据库。作为上述方法的优选，构建本地突变数据库时，统计深度＞20X的变异。作为上述方法的优选，步骤S4中，需要进行校正的原始变异检测结果包括：变异频率在0.15～0.4的碱基替换变异和单碱基插入缺失变异。作为上述方法的优选，步骤S4中，校正的方法包括：在每个位置上比较待测样本的变异和本地突变数据库对应类型的变异，如果待测样本的变异与本地突变数据库的变异无显著差异，则将待测样本在该位置上的该变异剔除。作为上述方法的优选，步骤S5中，校正的具体方法包括：以正态分布作为模型，通过计算偏离度Z值，如果Z值≤2.5，则将待测样本在该位置上的该变异剔除；其中，Z值＝待测样本变异频率-本地突变数据库对应变异频率中位值本地突变数据库对应变异频率标准差。作为上述方法的优选，步骤S5中，参照人群频率数据库进行过滤的方法包括：如果在本地突变数据库中该变异的变异频率大于30％，而在人群频率数据库中所述变异的变异频率小于5％，则检验其Z值；如果Z值小于3，则作为假阳性突变过滤。作为上述方法的优选，所述苯丙酮尿症致病基因包括PAH、PTS、GCH1、QDPR、PCBD1、SPR基因。基于半导体测序的苯丙酮尿症致病基因变异检测装置，包括：测序单元：用于针对苯丙酮尿症致病基因构建用于半导体测序的扩增子文库，将待测样本的扩增子文库上机测序，获得测序序列；质控过滤单元：用于将测序序列与人类基因组参考序列进行序列比对，根据比对结果进行质控过滤；变异分析单元：用于将质控后的测序序列进行变异分析，获取原始变异检测结果；校正单元；用于使用本地突变数据库对待测样本的原始变异检测结果进行校正；突变确定单元：用于对校正单元处理后的所有变异检测结果进行格式转换和变异注释，并参照人群频率数据库进行过滤，确定最终突变检测结果。本发明的有益效果是：本发明提供了一种基于半导体测序的PKU致病基因突变检测方法及装置，本发明通过构建本地突变数据库，全面反映检测范围内可能存在的背景噪音，能有效区分突变的真假阳性，解决了半导体测序平台固有的均聚碱基测序错误导致PKU检测背景噪音大的问题，并且可以较好控制不同批次测序质量的影响，提高了检测的准确性和稳定性，尤其适用于Proton平台。附图说明图1：基于半导体测序的PKU致病基因突变检测方法流程图；图2：基于半导体测序的PKU致病基因突变检测装置示意图。具体实施方式：参照图1，基于半导体测序的苯丙酮尿症致病基因突变检测方法，包括如下步骤：S1：针对苯丙酮尿症致病基因构建用于半导体测序的扩增子文库，将待测样本的扩增子文库上机测序，获得测序序列。优选的，所述苯丙酮尿症致病基因包括PAH、PTS、GCH1、QDPR、PCBD1、SPR基因；本领域技术人员可以根据以上6种致病基因设计捕获区段，采用探针捕获或多重PCR捕获方法，依据半导体测序平台要求制备扩增子文库，半导体测序平台包括但不限于IonProton、IonPGM测序。S2：将测序序列与人类基因组参考序列进行序列比对，根据比对结果进行质控过滤。优选的，所述根据比对结果进行质控过滤包括：去除低质量的、多匹配和非完全匹配到染色体上的测序序列，并剔除长度在扩增子片段长度范围以外的测序序列。S3：将质控过滤后的测序序列进行变异分析，获取原始变异检测结果。S4：使用本地突变数据库对待测样本的原始变异检测结果进行校正。其中，本地突变数据库的构建方法包括：汇集至少30个阴性对照样本的原始变异检测结果，统计各位置上各类型变异的出现次数、变异频率，变异深度，相关参数的中位值和标准差，形成本地突变数据库；优选的，构建本地突变数据库时，统计深度＞20X的变异。其中，需要进行校正的原始变异检测结果包括：变异频率在0.15～0.4的碱基替换变异和单碱基插入缺失变异。特别的，校正的方法包括：在每个位置上比较待测样本的变异和本地突变数据库对应类型的变异，如果待测样本的变异与本地突变数据库的变异无显著差异，则将待测样本在该位置上的该变异剔除。更进一步的，校正的具体方法包括：以正态分布作为模型，通过计算偏离度Z值，如果Z值≤2.5，则将待测样本在该位置上的该变异剔除；其中，Z值＝待测样本变异频率-本地突变数据库对应变异频率中位值本地突变数据库对应变异频率标准差。S5：对校正后的所有变异检测结果进行格式转换和变异注释，并参照人群频率数据库进行过滤，确定最终突变检测结果。优选的，参照人群频率数据库进行过滤的方法包括：如果在本地突变数据库中该变异的变异频率大于30％，而在人群频率数据库中所述变异的变异频率小于5％，则检验其Z值；如果Z值小于3，则作为假阳性突变过滤。参照图2，基于半导体测序的苯丙酮尿症致病基因变异检测装置，包括：测序单元：用于针对苯丙酮尿症致病基因构建用于半导体测序的扩增子文库，将待测样本的扩增子文库上机测序，获得测序序列；质控过滤单元：用于将测序序列与人类基因组参考序列进行序列比对，根据比对结果进行质控过滤；变异分析单元：用于将质控后的测序序列进行变异分析，获取原始变异检测结果；校正单元；用于使用本地突变数据库对待测样本的原始变异检测结果进行校正；突变确定单元：用于对校正单元处理后的所有变异检测结果进行格式转换和变异注释，并参照人群频率数据库进行过滤，确定最终突变检测结果。下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。本发明样本来源于河北省衡水妇幼保健院。本发明未特别说明的方法均采用本领域常规操作或按试剂盒说明书操作，不作赘述。实施例1本实施例以20例待测样本为例包括15例外周血5例干血斑，待测样本来源病例已通过临床确诊为PKU，另外选取40例阴性对照样本用于构建本地突变数据库。一种基于半导体测序的PKU致病基因突变检测流程，包括如下步骤：1、待测样本的扩增子测序取20例待测患者的外周血样品0.1～0.2mL或2～3片直径约6毫米的血斑采用MagPureTissue&BloodDNALQKit进行基因组DNA提取，按IonProton测序文库构建方法，构建针对苯丙酮尿症致病基因PAH、PTS、GCH1、QDPR、PCBD1、SPR基因的扩增子文库，采用Proton基因测序仪进行上机测序，获得每位受检者的测序序列。2、测序序列的比对使用Tmap软件将各个样本的测序序列比对至人类参考基因组hg19版本，获得测序序列的基因组坐标，根据基因组坐标使用Samtools软件进行排序，并建立比对结果的索引文件。3、测序序列的质控根据比对结果进行质控，为了保证测序结果的质量及避免一些重复序列的干扰，去除低质量的、多匹配和非完全匹配到染色体上的测序序列，并剔除长度在扩增子片段长度范围以外的测序序列。根据目标扩增范围，保留能刚好覆盖目标区域的序列作为有效数据，其数据利用率能达到60％～80％；同时统计碱基序列数目、总碱基数目、测序质量比值、平均碱基序列长度、测序深度、比对率、数据利用率等质控指标，用作样本数据的质控判断。4、变异分析使用TorrentVariantCaller软件对质控后的测序序列进行变异检测，同时使用Samtools软件的mpileup模块获取原始变异检测结果。5、构建本地突变数据库使用40个阴性对照样本参与构建本地突变数据库，按步骤1～4，即：获得测序序列后，通过比对、质控、变异分析，获得38个阴性样本的原始变异检测结果，统计深度20X的变异，具体统计各位置上各类型变异的出现次数、变异频率，变异深度，相关参数的中位值和标准差，形成本地突变数据库。6、变异校正使用本地突变数据库对待测样本的原始变异检测结果进行校正。具体方法为：针对变异频率在0.15～0.4的碱基替换变异和单碱基插入缺失变异；以正态分布作为模型，通过计算偏离度Z值，如果Z值≤2.5，即认为待测样本的变异的频率与本地突变数据库的变异频率分布无显著差异，则将待测样本在该位置上的该变异剔除；Z值的计算公式：Z值＝待测样本变异频率-本地突变数据库对应变异频率中位值本地突变数据库对应变异频率标准差。7、突变确定对校正后的所有变异检测结果进行格式转换和变异注释，并参照人群频率数据库，在本地突变数据库中该变异的变异频率大于30％，而在人群频率数据库中所述变异的变异频率小于5％，则检验其Z值；如果Z值小于3，则作为假阳性突变过滤，获得最终突变检测结果。表1给出以上20例样本的最终突变检测结果及sanger测序结果，可见本发明检测结果与sanger结果完全一致，无假阳性和假阴性。表1、20例PKU确诊样本检测结果实施例2本实施例对一个受检家系进行检测，检测方法同实施例1，表2～4给出检测过程中输出的原始变异检测结果，最终突变检测结果及sanger测序结果，可见最终突变检测结果与sanger测序结果一致，而原始变异检测结果部分存在假阳性或假阴性的情况。表2、受检家系PKU-01样本的检测结果表3、受检家系PKU-02样本的检测结果表4、受检家系PKU-03样本的检测结果

权利要求：1.基于半导体测序的苯丙酮尿症致病基因突变检测方法，所述方法用于非疾病诊断目的，包括如下步骤：S1：针对苯丙酮尿症致病基因构建用于半导体测序的扩增子文库，将待测样本的扩增子文库上机测序，获得测序序列；S2：将测序序列与人类基因组参考序列进行序列比对，根据比对结果进行质控过滤；S3：将质控过滤后的测序序列进行变异分析，获取原始变异检测结果；S4：使用本地突变数据库对待测样本的原始变异检测结果进行校正；其中，本地突变数据库的构建方法包括：汇集至少30个阴性对照样本的原始变异检测结果，统计各位置上各类型变异的出现次数、变异频率，变异深度，相关参数的中位值和标准差，形成本地突变数据库；构建本地突变数据库时，统计深度＞20X的变异；需要进行校正的原始变异检测结果包括：变异频率在0.15～0.4的碱基替换变异和单碱基插入缺失变异；校正的方法包括：以正态分布作为模型，通过计算偏离度Z值，如果Z值≤2.5，则将待测样本在该位置上的该变异剔除；其中，Z值＝待测样本变异频率-本地突变数据库对应变异频率中位值本地突变数据库对应变异频率标准差；S5：对校正后的所有变异检测结果进行格式转换和变异注释，并参照人群频率数据库进行过滤，确定最终突变检测结果；参照人群频率数据库进行过滤的方法包括：如果在本地突变数据库中该变异的变异频率大于30％，而在人群频率数据库中所述变异的变异频率小于5％，则检验其Z值；如果Z值小于3，则作为假阳性突变过滤。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S2中，所述根据比对结果进行质控过滤包括：去除低质量的、多匹配和非完全匹配到染色体上的测序序列，并剔除长度在扩增子片段长度范围以外的测序序列。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述苯丙酮尿症致病基因包括PAH、PTS、GCH1、QDPR、PCBD1、SPR基因。4.基于半导体测序的苯丙酮尿症致病基因变异检测装置，包括：测序单元：用于针对苯丙酮尿症致病基因构建用于半导体测序的扩增子文库，将待测样本的扩增子文库上机测序，获得测序序列；质控过滤单元：用于将测序序列与人类基因组参考序列进行序列比对，根据比对结果进行质控过滤；变异分析单元：用于将质控后的测序序列进行变异分析，获取原始变异检测结果；校正单元；使用本地突变数据库对待测样本的原始变异检测结果进行校正；其中，本地突变数据库的构建方法包括：汇集至少30个阴性对照样本的原始变异检测结果，统计各位置上各类型变异的出现次数、变异频率，变异深度，相关参数的中位值和标准差，形成本地突变数据库；构建本地突变数据库时，统计深度＞20X的变异；需要进行校正的原始变异检测结果包括：变异频率在0.15～0.4的碱基替换变异和单碱基插入缺失变异；校正的方法包括：以正态分布作为模型，通过计算偏离度Z值，如果Z值≤2.5，则将待测样本在该位置上的该变异剔除；其中，Z值＝待测样本变异频率-本地突变数据库对应变异频率中位值本地突变数据库对应变异频率标准差；突变确定单元：用于对校正单元处理后的所有变异检测结果进行格式转换和变异注释，并参照人群频率数据库进行过滤，确定最终突变检测结果；参照人群频率数据库进行过滤的方法包括：如果在本地突变数据库中该变异的变异频率大于30％，而在人群频率数据库中所述变异的变异频率小于5％，则检验其Z值；如果Z值小于3，则作为假阳性突变过滤。

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