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申请/专利权人：农业部沼气科学研究所

摘要：本发明公开了一种浮萍转录因子LmMYB基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明还公开了浮萍转录因子LmMYB蛋白以及包含前述LmMYB基因的重组载体和重组菌及其用途。本发明浮萍转录因子LmMYB基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其可以调解植物耐高铵胁迫的能力，可以通过转入该基因来增加植物耐高铵胁迫的能力，对生长于受到高铵胁迫的植物有重要意义，具有良好的应用前景。

主权项：1.一种浮萍转录因子LmMYB基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

全文数据：浮萍转录因子LmMYB基因及其应用技术领域本发明涉及一种浮萍转录因子LmMYB基因及其应用。背景技术转录因子是转录起始过程中RNA聚合酶的辅助因子，若缺少转录因子，RNA聚合酶无法催化DNA模板链转录成RNA，则基因无法进行后续的加工和翻译，只有转录因子结合在相应顺式元件的核心DNA序列上，基因才能正常表达，可见转录因子在植物的各种生命活动中有着不可替代的位置。MYB转录因子是近年来发现的一类与调控植物生长发育、生理代谢、细胞的形态和模式建成等生理过程有关的一类转录因子，在植物中普遍存在，同时也是植物中最大的转录家族之一，MYB转录因子在植物的代谢和调控中发挥重要作用。MYB基因家族中只有极少数成员在调控某些生理生化过程中起负调控作用，一般起正调控作用，以MYB类转录因子在响应植物逆境过程为例，MYB基因表达量越高，其抵抗逆境的能力越强。现有研究表明MYB基因在农作物、鲜花、水果、烟草中都大量存在，如拟南芥中已经发现超过198个MYB基因，棉花、草莓和番茄等植物中都发现超过200个MYB基因。大多数MYB蛋白在N端含有一段氨基酸残基组成的MYB结构域，根据这个高度保守的结构域的结构特征可将MYB转录因子分为四类：1R-MYBMYB-related；R2R3-MYB；3R-MYB；4R-MYB4个R1R2的重复。MYB转录因子具有多种生物学功能，广泛参与植物根、茎、叶、花的生长发育，与此同时，MYB基因家族对干旱、盐渍、冷害等非生物胁迫过程也有响应，此外MYB转录因子还与某些经济作物的品质好坏密切相关。氨氮是指水中以游离氨NH3和铵离子NH4+形式存在的氮，是水体中主要的污染物之一，会造成富营养化、水生植物多样性减少等危害。我国从“十二五”开始将氨氮纳入污染物控制指标，畜禽养殖业是氨氮减排重点之一。畜禽养殖废水中含有较高浓度的氨氮，目前主要采用厌氧-好氧工艺进行脱氮除磷，其中好氧过程耗能较高。人工湿地、氧化塘等低能耗工艺能够有效的利用植物和微生物的共同作用达到良好的脱氮效果，但是过高的氨氮会对植物造成伤害，不利于其正常运转。NH3和NH4+都可以对植物造成伤害，但是这二者之间的转换受环境温度和pH控制，在大多数的土壤或水体环境中游离氨所占比例较低，对植物造成影响的主要是NH4+，因此NH4+毒害也受到更多的关注。NH4+毒害会抑制植物的生长发育，对农业和其它生态系统有一定的负面影响，如一些地区的粮食减产、森林面积降低、水生植物减少被认为与土壤中或水环境中NH4+的升高密切相关。尤其是在农业方面，过度氮肥的使用、不合理的施肥方式以及大气NH3NH4+沉降的加剧等因素都会使土壤中NH4+浓度增加，NH4+毒害对农业生产的威胁将越来越明显。提高作物自身的抗高铵能力有利于减少由NH4+毒害带来的经济损失。提高水生植物对高铵的耐受能力有助于更好的利用这些植物净化废水。未见浮萍的MYB基因相关的报道，也未见MYB基因与植物抗高铵胁迫相关的报道。发明内容本发明提供了浮萍LemnaminorL.的MYB基因及其应用。本发明提供了浮萍转录因子LmMYB基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明还提供了一种重组载体，它包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；优选地，所述重组载体是重组pCAMBIA1302质粒。本发明还提供了一种重组菌，它包括前述重组载体。优选地，所述重组菌是重组根癌农杆菌。进一步优选地，所述重组根癌农杆菌是重组根癌农杆菌EHA105。本发明还提供了一种浮萍转录因子LmMYB蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明还提供了前述的基因、蛋白、重组载体和重组菌在提高植物耐高铵能力中的用途。本发明还提供了一种提高植物耐高铵胁迫的方法，步骤如下：取前述的基因、重组载体和重组菌，转入植物的基因组中，即可。本发明还提供了一种制备转基因水稻的方法，取水稻，转入前述的基因、重组载体和重组菌，即可。本发明的LmMYB基因是能够针对性调控植物耐高铵能力提高的转录因子基因；且该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。本发明通过对LmMYB基因转化水稻进行该基因的功能研究，获得效果如下：1.获得了对高铵胁迫有较高耐受性的转基因水稻。2.LmMYB基因具有抵抗高铵胁迫逆境的功能，为利用该基因在其他植物上的应用而提高植物抗逆性提供了理论依据及利用价值。本发明LmMYB基因能够提高植物耐高铵胁迫的能力，制备得到的含有LmMYB基因的转基因水稻在高铵环境下生长良好，可以克服由于高铵污染导致的农作物减产等等问题，应用前景良好。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1为实施例1中浮萍叶状体总RNA的琼脂糖凝胶电泳图，图中，M泳道：分子量标记AL2000DNAMarker，购自艾德莱公司，1泳道：浮萍叶状体总RNA。图2为实施例1中转录组数据使用的LmMYB基因中间片段序列。图3为实施例1中3'Race扩增LmMYB基因的下游片段电泳图，图中，M泳道：分子量标记AL2000DNAMarker，1泳道：LmMYB下游片段的PCR扩增结果。图4为实施例1中5'Race扩增LmMYB基因的上游片段电泳图，图中，M泳道：分子量标记AL2000DNAMarker，1泳道：LmMYB上游片段的PCR扩增结果。图5为实施例1中LmMYB基因ORF的PCR扩增结果电泳图，图中，M泳道：分子量标记AL2000DNAMarker，1泳道：LmMYB基因ORF的PCR扩增结果。图6为LmMYB与水稻、玉米等植物MYB家族转录因子氨基酸序列同源性比对。图7为LmMYB与水稻、玉米等其他植物MYB转录因子氨基酸序列比对后所作进化树。图8为LmMYB基因在不同浓度铵NH4Cl处理条件下的诱导表达谱变化情况。图9为PCR扩增反应结果。图10为RT-PCR检测结果。图11为转浮萍LmMYB基因水稻材料B、D与对照A、C分别在84mgLA、B和840mgLC、D的NH4+-N的Hoagland培养液中的生长情况。具体实施方式下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等著的分子克隆：实验室手册NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989，或按照制造厂商所建议的条件及实验步骤。下述实施例中，所用浮萍为实验室从废水中获得的一株耐高铵浮萍，浮萍为无性繁殖，所有材料均来自同一个克隆，长期培养在Hoagland培养液中。培养箱培养条件为23±1℃，光周期1212h。实施例1：浮萍LmMYB基因的分子克隆1、浮萍叶片总RNA的提取浮萍叶片总RNA的提取使用PlantRNeasyKitQiagen，具体步骤如下：1取浮萍叶片≤0.1g，液氮充分研磨，加入450μlRLC预先加入β-巯基乙醇，剧烈振荡；2将液体移入紫色滤柱中，置于2ml收集管，室温，14,000rpm离心2min，滤液入1.5mlEP管，小心勿吸入沉淀；3加入相当于滤液12体积的无水乙醇，抽打混匀；4将样品，包括沉淀移入粉色滤柱，室温，10,000rpm离心15s，弃滤液；5加入700μlRW1buffer，室温，10,000rpm离心15s，清洗过柱；6加入500μlRPE，室温，10,000rpm离心15s，清洗过柱，重复该操作一次；7室温，14,000rpm离心1min，弃滤液；8将滤柱放入1.5ml收集管中，加入30～50μlRNase-free水，室温，10,000rpm离心1min即得浮萍叶片总RNA。其琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。2、浮萍LmMYB基因3'端部分片段和5'端部分片段克隆的获得2.1ReverseTranscriptaseM-MLV合成cDNA第一链按照反转录酶M-MLVTaKaRa的操作说明进行，以步骤1所得浮萍叶状体总RNA为模板，OligodT18为引物。在RNase-free的0.2mlPCR管中加入浮萍叶状体总RNA3μl约500ng，OligodT1850μM1μl，用RNase-freeddH2O将体积补充至6μl。混匀后，70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上，然后短暂离心使管中溶液集于EP管底部。在冰上依次加入以下试剂：5×M-MLVBuffer2μl；dNTP10μM0.5μl；RNaseInhibitor0.3μl；RTaseM-MLV0.5μl；RNase-freeddH2O0.7μl。混合均匀后再次放入PCR仪42℃反应1h，70℃反应10min，存于-20℃备用。引物OligodT18序列为：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGT18-3′2.2浮萍LmMYB基因3'端部分片段克隆的获得本研究以课题组前期实验获得的浮萍高铵胁迫处理转录组数据为基础，用获得的LmMYB部分序列图2为基础，分别设计3’和5’RACE引物。利用正向引物LmMYB3-1和AP进行3′-RACEPCR扩增，第一轮扩增反应如下：PCR反应体系配比表20μLPCR循环系统第二轮PCR将所得到的第一轮PCR产物用ddH2O稀释50倍0.4ul一扩PCR产物+19.6ulddH2O为模板，以LmMYB3-2和AP1为引物进行PCR。第二轮PCR如下：PCR反应体系配比表50μlPCR循环系统将获得的第二次PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪筛选目的DNA条带，在紫外割胶仪下割下目的条带，用天跟公司的DNA试剂盒进行胶回收，回收后DNA片段连接pEASY-T1载体TransGenBiotech，转化大肠杆菌后，挑选白色菌落进行菌落PCR，菌落经PCR验证后选择阳性克隆测序分析，挑取阳性菌落送往北京六合华大基因有限公司测序，所得序列长度为550bp图3。2.3、浮萍LmMYB基因5'端部分片段克隆的获得5′-RACE采用TaKaRa公司TerminalDeoxynucleotidylTransferaseTdT法进行：1首链cDNA的合成，将10μl的浮萍叶状体RNA与0.5μl的引物LmMYB5-RTLmMYB5-RT：TCTCGTTGTCTGTTCTACCC和1μl的RNaseinhibitor混合均匀，70℃放置10min后冰浴2min，短暂离心；随后加入5μl的5×RTBuffer，1.25μl的dNTPMixture各10mmolL和2.25μl的DTT100mmolL，加去RNase水至总体积24μl，混匀后42℃放置1min，再加入1μl的AMVReverseTranscriptaseXL，55℃下反应2h，再70℃处理15min后，短暂离心。2RNA的降解和cDNA的纯化，将前一步得到的25μlcDNA和1μl的RNase混合，37℃下放置30min；随后用天根公司的DNA回收柱进行纯化cDNA。3cDNA末端加尾反应体系如下：5μl5×TDTBuffer，15μlcDNA，2.5μl0.1％BSA，0.5μldATP100mmolL，加入ddH2O至总体积24μl。将上述反应液94℃处理2～3min后冰浴1min，加入1μlTdT，37℃放置12h，然后65℃处理10min，冰上冷却后短暂离心。4以上一步获得的反应液为模板，以LmMYB5-1LmMYB5-1:GATAGCGGACCATTTGTTGC和APOligodT-3sitesAdaptorPrimer为引物，用ExTaq酶PCR，反应中退火温度为50℃，扩增30个循环PCR产物电泳观察结果。将所得产物用ddH2O稀释50倍为模板，再以LmMYB5-2LmMYB5-2:GCCCTTTTTTCAAGCCCG和AP1为引物进行第二轮PCR。所得产物经回收后克隆到pEASY-T1载体上，转化E.coliTop10感受态细胞。菌落经PCR产物电泳观察结果验证后，挑取阳性菌落送往北京六合华大基因有限公司测序，所得序列长度为490bp图4。并将所得序列在NCBI上进行比对分析。3、浮萍LmMYB基因开放阅读框ORF的获得根据已获得的中间片段、3'片段和5'片段拼接出LmMYB基因全长cDNA，据此设计扩增ORF的特异引物LmMYB1和LmMYB2，以浮萍叶状体的cDNA为模板，于冰上在一个0.2ml的EP管中加入以下组分：引物序列如下：LmMYB1：5′-ATGGGGAGGAGTCCCTGCTG-3′LmMYB2：5′-TTAGAATCGTTGATTGGAGACGGAG-3′循环条件为：95℃3min，35个循环94℃30s、62℃30s、72℃1min，72℃10min。经测序得到642bp的ORF全长图5，其序列SEQIDNO：1：ATGGGGAGGAGTCCCTGCTGCGAGAACGCGGGCTTGAAAAAAGGGCAGTGGACGGCGCAAGAGGACCAGATACTCGTCTCCTATATTCGCCAATTCGGCCACGCCAACTGGCGCGCTCTCCCCAAGCTCGCCGGCCTTGCGAGATGCGGCAAGAGCTGCAGGCTTCGGTGGATGAACTATCTCCGACCGGATATCAAGCGGGGAAACTTCTCCCCAGAGGAGGAGGACGCCATCCTCAGGCTTCACGCGTCGCTCGGCAACAAATGGTCCGCTATCGCTGCCGAGCTCCCGGGTAGAACAGACAACGAGATCAAGAACGTGTGGCACACGCACTTGAAGAAGAGGGCCAGCCTCCGCAAGATCGATCGTGGCGAACCGTCTTGCGGCGACCTATCTTCGTCTTCTTCTTCTTGTGCGACCGAAGATGGGGCTCAGTTGCTCCCCGAGCTTCTGGAGATGGATGACGAGGAATGGTGGTCGGAGGCTCTCTTCCAGGAGACTTGTACGTCGAATTTGGGATCATCCAGGGCTTCGTCCGAAGGGGGGACGGACGCGTCGTCAGAGGAAGGCGACGACAATTTCTGGGTGAGGCTGCTGATGGCGACCGAGTTTCCCGACTCCGTCTCCAATCAACGATTCTAA。其编码的蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：2：MGRSPCCENAGLKKGQWTAQEDQILVSYIRQFGHANWRALPKLAGLARCGKSCRLRWMNYLRPDIKRGNFSPEEEDAILRLHASLGNKWSAIAAELPGRTDNEIKNVWHTHLKKRASLRKIDRGEPSCGDLSSSSSSCATEDGAQLLPELLEMDDEEWWSEALFQETCTSNLGSSRASSEGGTDASSEEGDDNFWVRLLMATEFPDSVSNQRF实施例2：浮萍LmMYB基因的分析1、生物信息学分析使用软件DNAMAN、PrimerPremier5.0及NCBI上的Blast程序对LmMYB序列序列表中SEQIDNO：1和LmMYB基因编码的多肽的氨基酸序列序列表中SEQIDNO：2进行同源性分析和保守区域分析。2、荧光定量PCR检测LmMYB基因表达模式2.1荧光定量PCR引物设计根据克隆出的LmMYBcDNA全长序列设计了QP1和QP2作为检测LmMYB基因表达水平的荧光定量PCR引物，选取18S作为内参基因，引物为18SP1和18SP2。引物序列如下：QP1：5′-TGGATGAACTATCTCCGACCG-3′QP2：5′-CAGCGATAGCGGACCATTTG-3′18SP1：5′-AGAGGAACAGTCGGGGGCATT-3′18SP2：5′-CGGCATCGTTTACGGTTGAGA-3′2.2准备不同浓度铵胁迫条件下基因表达模式分析所用材料NH4Cl胁迫处理：将浮萍洗干净后，以Hoagland培养液84mgL-1NO3--N为对照，设84和840mgL-12个高铵浓度处理，处理7天，分别在0d、2d、4d和7d取叶状体。2.3RT按照实施例1的浮萍叶状体总RNA的提取方法，从2.2不同浓度铵胁迫条件下的浮萍叶状体中分别提取它们的总RNA，所得总RNA使用BIO-RAD公司的iScriptTMcDNASynthesisKit进行反转录。用硅化枪头在0.2ml的RNase-free硅化EP管中加入以下组分：在PCR仪上按以下程序进行反应：25℃5min，42℃30min，85℃5min。所得cDNA用Nuclease-freewater稀释10倍，-20℃保存备用。2.4荧光定量PCR荧光定量PCR所用试剂盒为BIO-RAD公司的SsoFastTMSuperemix，PCR反应在IQ5PCR仪BIO-RAD公司上进行，用硅化枪头在0.2ml的硅化EP管中加入以下组分：反应程序为95℃变性2min后，进入95℃10s，60℃1min的45个循环，最后从65℃到95℃进行溶解曲线分析，去除引物二聚体和其他非特异性扩增。每个样品均重复三次以避免加样误差，实验数据利用iQ5-Cycler软件进行分析，分析方法为ΔΔCt法。3、结果3.1同源性分析以序列表中SEQIDNO：1所述LmMYB基因序列编码的多肽的氨基酸序列序列表中SEQIDNO：2为询问序列，在NCBI上进行Blastp，发现其与水稻Oryzasativa，CAA74603.1和玉米Zeamays，XP_008669188.1的MYB家族转录因子基因同源性较高，均为80％。随后分别用DNAMAN软件和Mega4.0软件对NCBI公布的高等植物MYB家族转录因子氨基酸序列进行同源性比较和进化树绘制，结果与NCBIBlastp相同，由图6和图7看出，与LmMYB亲缘关系最近的是水稻，其次是玉米和大麦。3.2保守区域分析通过同源性比对，如图6所示，本发明所述LmMYB基因编码的氨基酸序列包含2个MYB家族共有的保守区域，即MYBDNAbindingsite.3.3不同浓度铵NH4Cl胁迫下基因表达模式分析目前对于MYB蛋白功能研究的比较深入的是拟南芥，其家族不同成员可被NaCl、干旱及冷等其他非生物胁迫诱导表达，但未有报道MYB蛋白可被铵胁迫诱导表达，为推测LmMYB蛋白的生物功能，本发明使用不同浓度铵NH4Cl对浮萍进行胁迫处理，如图8所示，本发明所述LmMYB基因的表达受到铵胁迫所诱导。在84mgL的铵条件下LmMYB基因的表达量是同等硝态氮浓度下的7倍，在840mgL的铵条件下该基因的表达量增加到15倍左右。综合上述LmMYB基因的各类分析，初步推测LmMYB基因可能参与浮萍抗高铵的生物应答活动当中。故构建真核重组质粒转化野生型水稻植株，进一步检验其功能。实施例3：真核重组质粒的构建及其功能验证1、材料1.1植物材料水稻品种粳稻种子由武汉伯远生物科技有限公司所提供。种子于光照培养箱培养，28℃光照16h，黑暗8h。1.2菌株大肠杆菌EscherichiacoliDH5α:购自TIANGEN公司；农杆菌AgrobacteriumtumefaciensEHA105：购自北京全式金公司。1.3质粒pEASY–T1：是一种高效克隆PCR产物TAcloning的专用载体，购自TransGenBiotech；植物双元表达载体pCAMBIA1302：含有潮霉素抗性基因Hyg、CaMV35S启动子，由农业部沼气科学研究所实验室保存。1.4培养基和溶液LB液体培养基：胰蛋白胨10gL，酵母浸出物5gL，NaCl5gL。LB固体培养基：在液体培养基的基础上加入12.5gL琼脂粉。YEB液体培养基：牛肉浸膏5gL，酵母提取物5gL，蛋白胨5gL，蔗糖1gL，MgSO4·7H2O0.5gL。YEB固体培养基：在液体YEB培养基的基础上加15gL的琼脂粉。基本培养基为NB培养基，愈伤组织的诱导与继代，转化与筛选及分化与生根培养基如下所有培养基的PH均用KOH来调节：诱导培养基：NB+2,4-D2mgL；PH＝5.8-6.0继代培养基：NB+2,4-D2mgL+Vc40mgL；PH＝5.8-6.0预培养培养基：NB+2,4-D2mgL；PH＝5.8-6.0菌体悬浮培养基：AAM+AS100μmolL；PH＝5.2共培养培养基：NB+2,4-D2mgL+AS100μmolL；PH＝5.8-6.0筛选培养基一：NB+2,4-D2mgL+Ti100mgL+Hyg30mgL；PH＝5.8-6.0筛选培养基二：NB+2,4-D2mgL+Ti100mgL+Hyg50mgL；PH＝5.8-6.0分化培养基：NB+KT10mgL+NAA0.4mgL；PH＝5.8-6.0生根培养基：12MS+NAA0.1mgL；PH＝5.8-6.0上述培养基和溶液均在121℃高压灭菌20min后备用，抗生素需待培养基冷却到50℃左右时加入。2、实验方法2.1LmMYB基因ORF全长的获得经测序分析得知，LmMYB基因的ORF序列中没有BamHI和HindIII的酶切位点，因此，我们设计了构建真核重组质粒的引物如下粗体字为保护碱基，斜体字为酶切位点：BamH-F1：5′-ATGGGGAGGAGTCCCTGCTG-3'Hind-R1：5′-GAATCGTTGATTGGAGACGGAG-3'按实施例1中的实验方法进行RT-PCR，循环条件为：95℃3min，35个循环94℃30s、62℃30s、72℃1min，72℃10min。然后进行胶回收、连接pEASY–T1载体、转化大肠杆菌后测序。本发明LmMYB基因ORF全长也可以按照SEQIDNO：1所示序列直接合成。2.2pEASY-LmMYB质粒提取选取测序成功的菌液进行扩大培养，使用质粒提取试剂盒PlasmidMiniKitIOmega，得到质粒pEASY-LmMYB。所有操作均在常温下进行，具体步骤如下：1取菌液1.5～5ml，10,000rpm离心1min，弃上清；2向沉淀中加250μlSolutionIRNaseA，振荡悬菌；3加250μlSolutionII，轻摆几次，待菌液澄清后放置2min；4加350μlSolutionIII，上下翻转数次至白色絮状物出现；5于13,000rpm，离心10min，取上清或静置待用时取上清；6将HibindDNA结合柱置于收集管，加200μlBufferGPS，室温放置3～5min；7于12,000rpm，离心2min，弃滤液；8取步骤5的上清于HibindDNA结合柱中，13,000rpm离心1min，弃滤液；9加500μlBufferHB，10,000rpm，离心1min，弃滤液；10加700μlDNAWashBuffer含无水乙醇，10,000rpm离心1min，弃滤液；11重复步骤10一次；12空柱，13,000rpm，离心2min，弃滤液，室温放置3～5min，挥干乙醇；13将HibindDNA结合柱置于新离心管上，取30～50μl无菌水或ElutionBuffer悬空滴加入结合柱中；14室温放置1～2min，13,000rpm，离心2min，-20℃保存备用。2.3构建真核重组质粒pCAMBIA1302-LmMYB构建方法，操作如下：将pEASY-LmMYB和pCAMBIA1302分别以BamHI、HindIII购自TaKaRa进行双酶切，反应体系如下：轻轻混匀，37℃水浴12～16h后，跑凝胶电泳分别回收带酶切位点的LmMYB基因片段和pCAMBIA1302载体酶切片段。再用T4连接酶购自TaKaRa对上述两种双酶切的胶回收产物进行连接，反应体系如下：轻轻混匀后，16℃温育12h。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，选取测序正确的菌落扩大培养并提取质粒pCAMBIA1302-LmMYB。2.4农杆菌感受态的制备1从YEB固体培养基上挑取农杆菌EHA105的单菌落，接种到10mlYEB液体培养基含100μgml利福平中，28℃，200rpm摇菌过夜；2吸取1ml菌液，加至50mlYEB液体培养基中，28℃，200rpm摇菌至OD600为0.5左右。34℃，5,000rpm，离心5min，弃上清；4菌体用10ml预冷的20mMCaCl2重悬，冰浴30min；54℃，5,000rpm，离心5min，弃上清；6菌体用约1ml预冷的20mMCaCl2重悬，分装后于-70℃保存。2.5农杆菌的转化1从超低温冰箱中取出农杆菌感受态，冰浴冻融；2将10μl本实施例2.3所构建的真核重组质粒pCAMBIA1302-LmMYB加入农杆菌感受态，轻轻混匀，冰浴30min；3于37℃水浴5min，迅速至冰上放置3～5min；4在无菌条件下加入800μl液体YEB培养基，于28℃，175rpm摇菌3～6h；5室温下，4,000rpm离心2min，弃上清；6菌体用约80μl液体YEB培养基重悬后涂布平板，于28℃培养两天；7挑取单菌落，用LmMYB全长特异引物LmMYB1和LmMYB2MYB1302-F:CGCggatccATGGGGAGGAGTCCCTGC；MYB1302-R:CCCaagcttGAATCGTTGATTGGAGACGG进行菌落PCRPCR反应条件为：94℃5min，35个循环94℃30s、60℃30s、72℃30s，72℃5min，选取PCR成功的培养物进行后续实验。2.6农杆菌侵染水稻1愈伤组织的预培养选取自然分散，结构致密，颜色鲜黄且直径约为2-3mm的胚性愈伤组织，转接至预培养培养基中，于培养箱28℃暗培养3-5d。2农杆菌的处理与转化在YEB固体培养基Kan50mgL，Rif50mgL划线，然后在28℃暗培养两天后，将农杆菌放置4℃冰箱中保存，侵染前两天在固体YEB培养基中划线培养。农杆菌在固体YEB培养基上28℃暗培养2d后，用5-10mlAAM培养基100μmolLAS将农杆菌洗脱，悬浮于100mlAAM培养基100μmolLAS中，振荡调整菌液浓度至OD600nm＝0.1-1.0，形成悬浮液，28℃静置1h。将经预培养的愈伤组织转至灭菌的50ml培养瓶中，加入上述处理的农杆菌悬浮液，轻微摇动后，静置30min，倒掉菌液，然后将愈伤于无菌滤纸上晾干并转接于共培养基中，28℃中暗培养3d。3洗脱农杆菌暗培养3d后，挑取愈伤组织接于灭菌的50ml广口培养瓶中，用灭菌的双蒸馏水冲洗，直至水中不见丝状菌体，最后一次冲洗用含100mgLTi的无菌水静置1h，然后倒掉水，将愈伤组织置于无菌滤纸上在操作台中吹干，然后转移至筛选培养基一上进行筛选。4抗性愈伤组织的筛选每两周将愈伤调换至新的筛选培养基上，约需三周即可见抗性愈伤组织从褐化干瘪的愈伤组织中长出。将抗性愈伤转接于筛选培养基中，10d左右观察抗性愈伤组织的色泽，颜色鲜黄，结构致密的抗性愈伤组织保留，并转至分化培养基二中，颜色暗淡的愈伤则淘汰掉。抗性愈伤转移至分化培养基2周后开始出现绿点，3周后可长出幼芽，并伴随根也长出。待幼苗长至2-3cm时转移至生根培养基上，每试管中1个克隆。幼苗长至10cm左右且根系生长旺盛时开始炼苗，7-10d后，移出试管，洗净根上的培养基，然后移至大田栽种。2.7转基因水稻的种植管理转基因水稻当代T0代植株随批及时种植。T0代自交种子T1代于2015年10月播种于海南，11月插秧，插植规格为20cm×20cm，单本植，按丰产田进行管理，力求均匀一致，及时防治病虫和其它危害。2.8转基因水稻的鉴定2.8.1PCR检测基因整合情况1水稻叶片DNA模板的制备CTAB法制备水稻基因组PCR模板a取约0.1g的水稻叶片在液态中磨成粉末，将适量的粉末材料转移至1.5mlEP管中。b加入600μl预热95℃的1.5×CTAB缓冲液，然后65℃温浴45min。c取出EP管，冷却后加入600μl氯仿:异戊醇24:1混合均匀，然后10,000rpm离心10min，取出后吸取上清液到另一新的EP管中。d加入23体积的异丙醇混合均匀，冰浴至DNA丝状物出现。e稍微离心沉淀DNA，倒掉上清液。f加入600μl75％乙醇洗涤，放置30min。g倒掉上清液，室温下吹干DNA。h加入100μlTE溶解DNA。2PCR检测以上述水稻叶片DNA野生和转基因为模板、LmMYB全长的特异引物LmMYB1和LmMYB2进行PCR，循环条件为：95℃3min，35个循环94℃30s、62℃30s、72℃1min，72℃10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析。2.8.2RT-PCR检测基因转录表达情况按实施例1方法提取转基因水稻的总RNA，用M-MLV反转录酶反转录合成cDNA第一链。以反转录产物为模板，用LmMYB全长的特异引物LmMYB1和LmMYB2进行PCR，该反应以水稻的ActinrRNA为参考基因，引物序列如下：OsActin_f:5'-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3'OsActin_r:5'-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3'循环条件为：95℃3min，35个循环94℃30s、62℃30s、72℃1min，72℃10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析。2.8.3转基因水稻种子的筛选1用50μgml的Hyg潮霉素水溶液彻底浸水滤纸，至于培养皿中，将收获的T0代种子均匀撒在滤纸上，28度培养箱暗培养两天后，于28度光照培养箱培养，每两天补一次Hyg水；2一周后，将萌发的Hyg抗性水稻幼苗移栽至花盆中，于光照培养箱生长为T1代植株，经PCR验证成功的植株分别收获水稻T2代种子并做好记录；3将鉴定成功的水稻T2代种子置于花盆中继续培养，用于后续实验。2.9转基因水稻的抗高铵胁迫能力验证以Hoagland培养液84mgLNO3--N为对照，设84和840mgL-12个高铵浓度NH4Cl处理，将经过潮霉素筛选和PCR鉴定的阳性植株转入对照和处理中，以没有转基因的水稻苗为对照，10d后测定植株高度、根长等指标。3、结果3.1转基因植株的鉴定3.1.1PCR检测分别提取野生型水稻和转LmMYB基因植株叶片的DNA，用LmMYB基因特异引物进行PCR扩增反应。结果显示，转基因水稻叶片扩增出642bp的特异片段如图9，而野生型对照水稻叶片没有扩增出该片段，因此判定LmMYB基因已整合入水稻的基因组DNA中。3.1.2RT-PCR检测为研究LmMYB基因在转基因水稻中的表达情况，对鉴定出的转基因水稻叶片在mRNA水平上进行了检测。分别以转基因水稻和野生型水稻叶片cDNA为模板，以LmMYB基因的特异引物进行RT-PCR反应，以水稻Actin基因为内参基因如图10。结果表明3棵阳性株全部都可扩增到目的片段，野生型水稻中无扩增产物，说明整合到转基因水稻基因组中的LmMYB基因可成功转录。3.1.3潮霉素抗性筛选水稻种子T1代阳性种子的比率为75.3％，T2代阳性种子的比率为80.2％.3.2水稻转基因植物的结果及分析如图11所示转LmMYB基因水稻材料B、D与对照A、C分别在84mgLA、B和840mgLC、D的NH4+-N的Hoagland培养液中的生长情况,具体的数据如下表所示：如上表和图11所示，在正常条件下，对照组与本发明含有LmMYB基因的转基因水稻的生长类似，在高铵胁迫下，对照组生长不佳，而含有本发明LmMYB基因的转基因水稻则仍然生长良好，说明转入本发明LmMYB基因可以有效对抗高铵胁迫，并且三株转基因植物的抗高铵胁迫能力均显著提升，说明含有本发明LmMYB基因的转基因植物稳定性较好。综上，本发明发现了浮萍转录因子LmMYB基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，确定了其可以调解植物耐高铵胁迫的能力，可以通过转入该基因来增加植物耐高铵胁迫的能力，对生长受到高铵胁迫的植物有重要意义，具有良好的应用前景。SEQUENCELISTING农业部沼气科学研究所浮萍转录因子LmMYB基因及其应用GY181-16P156718PatentInversion3.51642DNA本发明LmMYBORF全长1atggggaggagtccctgctgcgagaacgcgggcttgaaaaaagggcagtggacggcgcaa60gaggaccagatactcgtctcctatattcgccaattcggccacgccaactggcgcgctctc120cccaagctcgccggccttgcgagatgcggcaagagctgcaggcttcggtggatgaactat180ctccgaccggatatcaagcggggaaacttctccccagaggaggaggacgccatcctcagg240cttcacgcgtcgctcggcaacaaatggtccgctatcgctgccgagctcccgggtagaaca300gacaacgagatcaagaacgtgtggcacacgcacttgaagaagagggccagcctccgcaag360atcgatcgtggcgaaccgtcttgcggcgacctatcttcgtcttcttcttcttgtgcgacc420gaagatggggctcagttgctccccgagcttctggagatggatgacgaggaatggtggtcg480gaggctctcttccaggagacttgtacgtcgaatttgggatcatccagggcttcgtccgaa540ggggggacggacgcgtcgtcagaggaaggcgacgacaatttctgggtgaggctgctgatg600gcgaccgagtttcccgactccgtctccaatcaacgattctaa6422213PRT本发明LmMYB编码的蛋白的氨基酸序列2MetGlyArgSerProCysCysGluAsnAlaGlyLeuLysLysGlyGln151015TrpThrAlaGlnGluAspGlnIleLeuValSerTyrIleArgGlnPhe202530GlyHisAlaAsnTrpArgAlaLeuProLysLeuAlaGlyLeuAlaArg354045CysGlyLysSerCysArgLeuArgTrpMetAsnTyrLeuArgProAsp505560IleLysArgGlyAsnPheSerProGluGluGluAspAlaIleLeuArg65707580LeuHisAlaSerLeuGlyAsnLysTrpSerAlaIleAlaAlaGluLeu859095ProGlyArgThrAspAsnGluIleLysAsnValTrpHisThrHisLeu100105110LysLysArgAlaSerLeuArgLysIleAspArgGlyGluProSerCys115120125GlyAspLeuSerSerSerSerSerSerCysAlaThrGluAspGlyAla130135140GlnLeuLeuProGluLeuLeuGluMetAspAspGluGluTrpTrpSer145150155160GluAlaLeuPheGlnGluThrCysThrSerAsnLeuGlySerSerArg165170175AlaSerSerGluGlyGlyThrAspAlaSerSerGluGluGlyAspAsp180185190AsnPheTrpValArgLeuLeuMetAlaThrGluPheProAspSerVal195200205SerAsnGlnArgPhe210354DNA引物OligodT18序列3gctgtcaacgatacgctacgtaacggcatgacagtgtttttttttttttttttt54420DNALmMYB5-RTLmMYB5-RT4tctcgttgtctgttctaccc20520DNALmMYB5-15gatagcggaccatttgttgc20618DNALmMYB5-26gcccttttttcaagcccg18720DNALmMYB17atggggaggagtccctgctg20825DNALmMYB28ttagaatcgttgattggagacggag25921DNAQP19tggatgaactatctccgaccg211020DNAQP210cagcgatagcggaccatttg201121DNA18SP111agaggaacagtcgggggcatt211221DNA18SP212cggcatcgtttacggttgaga211329DNABamH-F113cgcggatccatggggaggagtccctgctg291431DNAHind-R114cccaagcttgaatcgttgattggagacggag311527DNAMYB1302-F15cgcggatccatggggaggagtccctgc271629DNAMYB1302-R16cccaagcttgaatcgttgattggagacgg291721DNAOs18sF17gactctggtgatggtgtcagc211820DNAOs18sR18ggctggaagaggacctcagg20

权利要求：1.一种浮萍转录因子LmMYB基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种重组载体，其特征在于：它包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是重组pCAMBIA1302质粒。4.一种重组菌，其特征在于：它包括权利要求2或3所述的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是重组根癌农杆菌。6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组根癌农杆菌是重组根癌农杆菌EHA105。7.一种浮萍转录因子LmMYB蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。8.权利要求1～6任意一项所述的基因、重组载体或重组菌在提高植物耐铵能力中的用途；所述植物为水稻。9.一种提高植物耐铵胁迫的方法，其特征在于：步骤如下：取权利要求1～6任意一项所述的基因、重组载体或重组菌，转入植物的基因组中，即可；所述植物为水稻。

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