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申请/专利权人：珠海科艺普检测科技有限公司

摘要：本发明提供了EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合和试剂盒，属于水生动物病原检测技术领域。所述引物探针组合采用双重实时荧光定量PCR检测方法，能够一次性同时利用EHP、SHIV的专用检测引物和探针进行两种病原DNA的扩增。本发明提供的检测试剂盒是一种方便、快速、检测限低，且特异性强灵敏度高准确率高、且能同时检测对虾虾肝肠胞虫、血细胞虹彩病毒的双重实时荧光定量PCR检测，适用于对虾隐性感染的早期监测。

主权项：1.一种EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合，其特征在于，包括检测EHP的引物探针组合和检测SHIV的引物探针组合；所述检测EHP的引物探针组合包括如SEQIDNo.1所示的正向引物EHP-F、如SEQIDNo.2所示的反向引物EHP-R和如SEQIDNo.3所示的探针EHP-Pro；所述检测SHIV的引物探针组合包括如SEQIDNo.4所示的正向引物SHIV-F、如SEQIDNo.5所示的反向引物SHIV-R和如SEQIDNo.6所示的探针SHIV-Pro。

全文数据：EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合和试剂盒技术领域本发明属于水生动物病原检测技术领域，具体涉及EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合和试剂盒。背景技术对虾血细胞虹彩病毒ShrimpHemocyteIridovirus，SHIV最早由Lightner和Redman于1993年在靠近厄瓜多尔的对虾养殖场中的原糙对虾ProtrachypeneprecipuaBurkenroad中发现的，病虾症状为活力较差，肝胰腺明显萎缩，肌肉发白，肠道发红、断裂，空肠空胃，鳃、步足及游泳足发黑。2017年，中科院黄海研究所科研人员在浙江严重死亡的南美白对虾上发现一种新病毒，它不属于虹彩病毒科下已建立的五个属，根据虾感染该病毒后的临床症状和病理症状，命名为虾血细胞虹彩病毒SHIV。而虾肝肠胞虫Enterocytozoonhepatopenaei，EHP是现阶段养殖对虾特别是南美白对虾的最大威胁，SHIV和EHP是我国对虾养殖过程中两种新发疫病，前者导致虾大量的死亡，后者导致对虾生长缓慢，参差不齐，甚至生长停滞，仅偶尔伴随有白便或者在应激条件下才出现大量死亡，所以养殖投入高结果收获甚微，给养殖业造成巨大的经济损失。目前，对虾病害种类较多，诊断手段主要包括病理学和生物学方法、免疫诊断法分子杂交、电镜观察及PCR技术。已建立的常规PCR技术，多是一次检测一种病原，检测耗时较长，检测灵敏度和准确性有待进一步提高。发明内容有鉴于此，本发明的目的在于提供一种EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合和试剂盒，不仅可以同时检测EHP和SHIV两种病原，而且检测灵敏度高、准确性好。本发明提供的一种EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合，包括检测EHP的引物探针组合和检测SHIV的引物探针组合；所述检测EHP的引物探针组合包括如SEQIDNo.1所示的正向引物EHP-F、如SEQIDNo.2所示的反向引物EHP-R和如SEQIDNo.3所示的探针EHP-Pro；所述检测SHIV的引物探针组合包括如SEQIDNo.4所示的正向引物SHIV-F、如SEQIDNo.5所示的反向引物SHIV-R和如SEQIDNo.6所示的探针SHIV-Pro。本发明提供了所述的引物探针组合在制备EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测试剂中的应用。本发明提供了一种EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括所述引物探针组合。优选的，还包括qPCRProbeMasterMix。优选的，在同一检测体系中，SHIV-F或SHIV-R的终浓度独立为0.4pmolμL，SHIV-Pro的终浓度为0.2pmolμL，EHP-F或EHP-R的终浓度独立为0.35pmolμL，EHP-Pro的终浓度为0.25pmolμL。优选的，用于检测EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR的扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性10s，退火温度60℃30s，共40个循环，每个循环结束时进行荧光信号采集。本发明提供的EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合，基于双重实时荧光定量PCR同时检测EHP和SHIV两种病原，具有耗时较少的特点，同时大大提高了检测结果的敏感性和准确性。实施例以虾血细胞虹彩病毒ShrimpHemocyteIridovirus，SHIV、虾肝肠胞虫Enterocytozoonhepatopenaei，EHP、传染性皮下及造血组织坏死病毒Infectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus，IHHNV以及白斑综合征病毒Whitespotsyndromevirus，WSSV的基因组为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，结果显示，仅有SHIV、EHP两种病毒相应的荧光信号为阳性，其他病毒的检测均为阴性，说明所述引物探针组合具有较强的特异性。对病原的早期诊断，便于及时采取有效的防治措施。经过敏感性实验结果表明，与构建的检测SHIV和EHP普通PCR及SYBRGreenReal-timePCR法相比较，本发明提供的双重荧光定量PCR引物探针组合是普通PCR法敏感性的100倍。附图说明图1为SHIVReal-timePCR标准曲线；图2为EHPReal-timePCR标准曲线；图3为双重实时荧光PCR体系的特异性检测结果；图4为荧光定量RT-PCR体系的敏感性检测；其中SHIVa至g和EHP1至7模板拷贝数依次为1×107、1×106、1×104、1×103、1×102和1×10。图5为EHP普通PCR敏感性检测结果；其中EHP2至8模板拷贝数1×10、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106和1×107；1：阴性对照；M为MarkerDL1000；图6为SHIV普通PCR敏感性检测，注：SHIV1至7模板拷贝数1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和1×10；1为阴性对照；M为MarkerDL1000。具体实施方式本发明提供的一种EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合，包括检测EHP的引物探针组合和检测SHIV的引物探针组合；所述检测EHP的引物探针组合包括如SEQIDNo.1所示的正向引物EHP-F、如SEQIDNo.2所示的反向引物EHP-R和如SEQIDNo.3所示的探针EHP-Pro；所述检测SHIV的引物探针组合包括如SEQIDNo.4所示的正向引物SHIV-F、如SEQIDNo.5所示的反向引物SHIV-R和如SEQIDNo.6所示的探针SHIV-Pro。所述EHP-F和EHP-R以EHP的基因组为模板扩增92bp长的片段；所述SHIV-F和SHIV-R以SHIV的基因组为模板扩增114bp长的片段。本发明对所述引物探针的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知引物探针来源即可。所述EHP-Pro和SHIV-Pro分别采用不同的荧光基团标记。本发明对所述荧光探针的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的荧光基团即可。在本发明实施例中，所述引物探针组合委托上海辉睿生物科技有限公司合成。本发明提供了所述的引物探针组合在制备EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测试剂中的应用。本发明提供了一种EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括所述引物探针组合。在本发明中，所述试剂盒中每种引物和探针优选单独分装。每种引物或探针的浓度优选为工作浓度的100倍。在本发明中，所述试剂盒优选还包括qPCRProbeMasterMix。本发明对所述qPCRProbeMasterMix的成分没有特殊限制，采用本领域所熟知的用于实时荧光定量PCR检测用组分即可。在本发明实施例中，所述qPCRProbeMasterMix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。在本发明中，所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：A.提取待检测样本的基因组DNA；B.以所述基因组DNA为模板，用所述引物探针组合进行实时荧光定量PCR检测，得到扩增曲线；C.根据SHIVReal-timePCR标准曲线和EHPReal-timePCR标准曲线计算待检测样本中SHIV或EHP的含量。本发明对待检测样本的基因组DNA的提取方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取方法即可。在本发明实施例中，所述待检测样本为Mabio病毒DNARNA提取试剂盒。在本发明中，所述实时荧光定量PCR检测的反应体系优选如下：AceQqPCRProbeMasterMix10μL，SHIV-F、SHIV-R、SHIV-Pro、EHP-F、EHP-R和EHP-Pro共4.9μL，模板DNA为2μL，无RNase的水补足反应体系为20μL，其中SHIVP-F或SHIV-R的终浓度独立优选为0.4pmolμL，SHIV-Pro的终浓度优选为0.2pmolμL，EHP-F或EHP-R的终浓度独立优选为0.35pmolμL，EHP-Pro的终浓度优选为0.25pmolμL。用于检测EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR的扩增程序优选如下：95℃预变性5min；95℃变性10s，退火温度60℃30s，共40个循环，每个循环结束时进行荧光信号采集。在本发明中，SHIVReal-timePCR标准曲线和EHPReal-timePCR标准曲线的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的Real-timePCR标准曲线的制备方法即可。下面结合实施例对本发明提供的一种EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合和试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例11、病毒核酸提取取发病虾组织肝胰腺、腮、肠道、肌肉，进行匀浆处理，得到组织匀浆液，具体方法如下：1先在2mL匀浆管中加入约3粒钢珠，大钢珠1粒直径4.5mm，小钢珠2粒直径2.5mm；2取发病虾组织肝胰腺、腮、肠道、肌肉约100mg病料至管中，加入500μLPBS；3将匀浆管置于组织匀浆器中匀浆1min；4将组织匀浆于-40℃冻存至少30min，再放回常温溶解，反复冻融2～3次，每次冻融均置于组织匀浆器匀浆1次；5在10,000×g条件下离心5min，将约200μL上清转移1.5mL离心管中，编号备用。2、实时荧光PCR检测1核酸提取依据Mabio病毒DNARNA提取试剂盒的说明书操作，阳性对照也需要同时提取，保存于-20℃备检。双重荧光定量PCR引物和探针的设计2设计EHP和SHIV的特异性引物和荧光探针，引物探针由上海辉睿生物科技有限公司合成，具体信息见表1。表1引物探针序列信息3标准品的制备取上述提取的总核酸。分别进行SHIV和EHP目的基因扩增。扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸8min。反应结束后，取5μLPCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增出SHIV114bp和EHP92bp目的基因。将获得的两者PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化，分别克隆至pMD18-T载体中，转化到DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆重组质粒，送上海辉睿生物科技有限公司测序鉴定。对于鉴定正确的重组质粒，分别命名为pMD-SHIV和pMD-EHP。对阳性质粒进行浓度测定、拷贝数计算，分装，-80℃保存备用。标准品的制备结果重组质粒的PCR检测结果显示，SHIV和EHP的扩增产物的大小分别为114bp和92bp，与预期大小一致。测序结果表明，克隆的虾肝肠胞虫目的基因序列、虾血细胞虹彩病毒目的基因序列分别与虾肝肠胞虫参考序列FJ496356.1，虾血细胞虹彩病毒参考序列KY681040.1的相似性达100％，而克隆表明目的基因被成功插入载体中。4实时荧光定量PCR标准曲线的建立将步骤3制备的SHIV和EHP的DNA标准品pMD-SHIV或pMD-EHP做10倍系列稀释，用不同稀释梯度的DNA作为模板，每个梯度的DNA设立3个重复。配制反应体系进行实时荧光定量PCR扩增，反应体系为20μL：AceQqPCRProbeMasterMix10μL，SHIV-F、SHIV-R、SHIV-Pro、EHP-F、EHP-R和EHP-Pro共4.9μL，模板DNA为2μL，无RNase的水补足反应体系为20μL，其中SHIVP-F或SHIV-R的终浓度独立优选为0.4pmolμL，SHIV-Pro的终浓度优选为0.2pmolμL，EHP-F或EHP-R的终浓度独立优选为0.35pmolμL，EHP-Pro的终浓度优选为0.25pmolμL。荧光定量PCR的反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性10s，退火温度60℃30s，共40个循环，每个循环结束时进行荧光信号采集。结果图1和图2。SHIV和EHP的荧光定量PCR反应标准品，其DNA混合液的梯度浓度从1×107copiesμL～1×101copiesμL的7个线性梯度的检测标准曲线呈等距性和平行性，具有较好的梯度性图1、2。实施例2特异性试验分别以提取的SHIV、EHP、传染性皮下及造血组织坏死病毒Infectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus，IHHNV、白斑综合征病毒Whitespotsyndromevirus，WSSV核酸为模板，按照标准曲线建立的方法分别进行PCR扩增，验证其特异性。以SHIV、EHP、IHHNV以及WSSV的基因组为模板进行实时荧光定量PCR扩增，结果显示，仅有SHIV、EHP二者相应的荧光信号为阳性，其他病毒的检测均为阴性，说明此次构建的双重实时荧光定量PCR方法的特异性较强图3。实施例3敏感性试验将测定好DNA浓度的模板进行10倍系列稀释，用已建立的双重实时荧光定量PCR方法测定其敏感性。将SHIV和EHP的DNA标准品，用核酸蛋白检测仪测定其浓度，计算其拷贝数，然后进行10倍系列梯度稀释，获得1×107copiesμL～1×101copiesμL，利用本研究建立的SHIV和EHP双重实时荧光定量进行扩增，得到SHIV和EHP探针法实时荧光定量PCR的动力学扩增曲线图4，在Ct＜40范围内可以检出的最低DNA量为10copiesμL，因此建立的此方法敏感性可以达到10copiesμL。与本实验室前期构建的检测SHIV和EHP普通PCR及SYBRGreenReal-timePCR法相比较，是普通PCR法敏感性的100倍图5、6。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表珠海科艺普检测科技有限公司EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合和试剂盒6SIPOSequenceListing1.0120DNA人工序列ArtificialSequence1aacgttaaagggtctcacgg20218DNA人工序列ArtificialSequence2gcttgatcggcatccttg18324DNA人工序列ArtificialSequence3aacaaatctcgagcccaatacgaa24421DNA人工序列ArtificialSequence4tagcagtaaactatgccgaca21518DNA人工序列ArtificialSequence5tatccgttccgctactct18623DNA人工序列ArtificialSequence6aactcaatggcttttaacaccac23

权利要求：1.一种EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测引物探针组合，其特征在于，包括检测EHP的引物探针组合和检测SHIV的引物探针组合；所述检测EHP的引物探针组合包括如SEQIDNo.1所示的正向引物EHP-F、如SEQIDNo.2所示的反向引物EHP-R和如SEQIDNo.3所示的探针EHP-Pro；所述检测SHIV的引物探针组合包括如SEQIDNo.4所示的正向引物SHIV-F、如SEQIDNo.5所示的反向引物SHIV-R和如SEQIDNo.6所示的探针SHIV-Pro。2.权利要求1所述的引物探针组合在制备EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测试剂中的应用。3.一种EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物探针组合。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括qPCRProbeMasterMix。5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，在同一检测体系中，SHIV-F或SHIV-R的终浓度独立为0.4pmolμL，SHIV-Pro的终浓度为0.2pmolμL，EHP-F或EHP-R的终浓度独立为0.35pmolμL，EHP-Pro的终浓度为0.25pmolμL。6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，用于检测EHP和SHIV双重实时荧光定量PCR的扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性10s，退火温度60℃30s，共40个循环，每个循环结束时进行荧光信号采集。

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