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申请/专利权人：吉林省畜牧兽医科学研究院

摘要：牛奶中耐药基因的微滴式数字PCR检测方法，属于耐药基因检测领域，包括：配制ddPCR反应混合液：ddPCRSupermix、上游引物、下游引物、探针、DNA模板和ddH2O；微滴生成；PCR扩增；荧光信号读取和QuantaSoft软件定量分析结果。本发明通过建立牛奶中耐药基因的ddPCR检测方法，能够完成牛奶中耐药基因的绝对定量分析并检测出较低的检出限，ddPCR能检出低至0.06copiesμL耐药基因的存在，明确了耐药基因的最低检测限。本发明与其他各耐药基因检测均不存在交叉反应，特异性良好，并且各组间变异系数范围在0.26％‑0.81％之间，重复性良好。

主权项：1.牛奶中耐药基因的微滴式数字PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1配制ddPCR反应混合液，包括：ddPCRSupermix、上游引物、下游引物、探针、DNA模板和ddH2O；所述上游引物、下游引物和探针的序列信息如下表所示： 名称 基因序列 5’修饰 3’修饰 AAC6'-Ie-F 5’-AATCCAAGAGCAATAAGGGCATAC-3’ AAC6'-Ie-R 5’-TCATTGCCTTAACATTTGTGGC-3’ AAC6'-Ie-P 5’-AGATTTGCCAGAACATGAATTACACGAGGG-3’ FAM BHQ1 AAC3-IIa-F 5’-GAGAATGCCGTTTGAATCGTAATC-3’ AAC3-IIa-R 5’-CGGTGGGTGACGTATGAGATG-3’ AAC3-IIa-P 5’-ACTTCACCGTCTCTTCCAGGCATCG-3’ FAM BHQ1 ANT6-Ia-F 5’-TTGCAATCGATCATCTGAACCA-3’ ANT6-Ia-R 5’-GGAATCCATGCGATATGTAGATAATAATC-3’ ANT6-Ia-P 5’-AGGATGATGTCGTGGAAGGTTGGGA-3’ FAM BHQ1 APH6-Id-F 5’-CGCTCACATATAATCAATGGCTCCTT-3’ APH6-Id-R 5’-ACAAAGGTCGTCTCTGTCAGCC-3’ APH6-Id-P 5’-CGGTCTGGTCGGTGAAGTGGGCT-3’ FAM BHQ1 APH3”-Ib-F 5’-TCTGTCTGGAGCGGATTTGC-3’ APH3”-Ib-R 5’-TCGGGATTGACGGCATTG-3’ APH3”-Ib-P 5’-CGCCGTTGATGTGGTGTCCCG-3’ FAM BHQ1 tetA-F 5’-CTACATCCTGCTTGCCTTCGC-3’ tetA-R 5’-GCCTGGACAACATTGCTTGC-3’ tetA-P 5’-TCCTGCTTGCTTCGGGTGGC-3’ FAM BHQ1 tetB-F 5’-GTCATTGCCGATACCACCTCAG-3’ tetB-R 5’-AAATCTCTCCTGCAAAACCACCA-3’ tetB-P 5’-AGTGGTTCGGTTGGTTAGGGGCA-3’ FAM BHQ1 tetD-F 5’-GCTGCTGTTATCCCTGGCG-3’ tetD-R 5’-CTGTCCGCCACTACCGAAGC-3’ tetD-P 5’-GCTGTGGATGTTGTATCTCGGGCG-3’ FAM BHQ1 tetO-F 5’-GGGGGTTCTTTATGGCTGCG-3’ tetO-R 5’-CGAAAGTCTGCGGGGGTACT-3’ tetO-P 5’-CAGGGGCTGTATGGATGGAAAGTGACA-3’ FAM BHQ1 tetS-F 5’-TTTCACCCACACAACTCAATTCA-3’ tetS-R 5’-ACTGAGTCTCGCAAATGTAGCGT-3’ tetS-P 5’-ATGATGGTCAACGGCTTGTCTATGTACG-3’ FAM BHQ1 2微滴生成；3PCR扩增；PCR反应程序为酶激活95℃，8-10min；变性94-98℃、20-30s，35-45个循环；退火延伸50-60℃60-90s，35-45个循环；酶失活98℃，8-10min；保存4℃；4荧光信号读取和QuantaSoft软件定量分析结果。

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