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申请/专利权人：四川农业大学

摘要：本发明公开了一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用。该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明基因具有正调控水稻粒长和千粒重的功能，能应用于增加水稻千粒重和提高水稻产量。

主权项：1.一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

全文数据：一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用技术领域本发明属于基因工程及遗传育种技术领域，具体涉及一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用。背景技术水稻是我国最重要的粮食作物之一，全国65％以上的人口以稻米为主食，稻米消费量极其巨大。水稻是我国第一大粮食作物，其种植面积、总产和单产均居粮食作物首位，在保障国家粮食安全中起着决定性作用。但近年来，随着我国人口持续增加、而农业劳动力数量不断减少、以及可耕地面积逐年减少、全球气候变暖等环境影响加剧，使我国水稻产业发展面临多方面挑战。因此，进一步提高水稻产量，对于确保我国粮食安全和农业可持续发展具有十分重要的战略意义。水稻产量属于复杂的农艺性状，由单株有效穗数、每穗粒数、结实率和千粒重组成，这些性状均是复杂的数量性状。千粒重作为水稻产量的直接组成因素之一，它是由粒型和籽粒充实度决定的。粒型主要包括粒长，粒宽以及粒厚3个方面。粒型不仅会影响水稻产量，而且还会影响水稻品质，尤其是其外观品质。因此挖掘粒型相关基因的遗传基础对水稻高产优质育种是十分必要的，目前已经有大量的粒型相关基因或者QTL位点被克隆，其中，粒长主效QTL位点包括：GS3、GL3.1、GS2、OsLG3、OsLG3bLGY3、TGW3GL3.3等；粒宽主效QTL位点包括：GW2、GS5、GW8、GW5GSE5、GL7GW7、OsOTUB1等。虽然目前已经报道不少粒型相关基因，但是对这些基因的调控机制研究仍然还只是片面化的，尤其是基因之间的互作关系，调控网络等还不清楚，迫切需要进一步挖掘粒型和千粒重相关基因。发明内容针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用，该基因具有正调控水稻粒长和千粒重的功能。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，该基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示的序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列。上述GLW10基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步地，该蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能的氨基酸序列。包含上述GLW10基因的质粒。包含上述GLW10基因的重组表达载体。包含上述GLW10基因的转基因细胞系。包含上述GLW10基因的工程菌。上述GLW10基因在改良水稻粒长和千粒重，提高水稻产量中的应用。本发明的有益效果为：本发明利用蜀恢498的EMS诱变小粒突变体glw10为研究材料，利用BSA混池测序，结合MutMap定位方法，定位到候选GLW10基因。利用CRISPRCas9系统编辑GLW10获得敲除转基因株系，敲除株系与野生型相比粒长显著降低，千粒重下降。而过量表达GLW10的转基因植株表现为粒长和千粒重显著增加，说明GLW10具有正调控水稻粒长和千粒重的功能，能应用于增加水稻千粒重和提高水稻产量。附图说明图1为GLW10基因敲除载体GLW10-BGK03结构示意图；图2为GLW10基因过量表达载体pCAMBIA2300-35S-GLW10-eGFP结构示意图；图3为GLW10基因敲除靶位点及敲除植株突变方式示意图；“.”表示该位置碱基缺失；图4为GLW10基因敲除株系粒型和千粒重考种数据；其中，“**”表示在0.01水平下差异显著；图5为GLW10基因敲除株系粒长和粒宽示意图；标尺为3mm；图6为GLW10基因过量表达转基因株系定量检测；其中，“**”表示在0.01水平下差异显著；图7为GLW10基因过量表达转基因株系粒型和千粒重考种数据；其中，“**”表示在0.01水平下差异显著；图8为GLW10基因过量表达转基因株系粒长和粒宽示意图，标尺为3mm。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。本发明在蜀恢498的EMS甲基磺酸乙酯诱变突变体库中意外发现一个小粒突变体glw10，将glw10与野生型蜀恢498杂交构建F2分离定位群体，将群体中极端小粒单株进行BSA混池测序，利用MutMap定位方法，定位到候选GLW10基因；利用CRISPRCas9系统敲除GLW10，发现该基因在调控水稻粒长和千粒重方面的功能。实施例1GLW10的CRISPRCas9敲除载体构建本发明利用百格公司的CRISPRCas载体构建试剂盒构建GLW10的敲除载体，具体过程如下：1利用http:skl.scau.edu.cn网站的targetDesign在线工具，设计敲除靶位点；在网站输入GLW10基因核苷酸序列SEQIDNO.2，生成19bp的gRNA靶点序列T1，该靶点序列如下：T1：5’-GGGTGCTTCCTGTCCAAGC-3’SEQIDNO.32将以上靶点序列T1输入百格公司Oligo序列在线设计网站http:121.41.105.238indexexcrispr，选择BGK03载体，生成与试剂盒对应的Oligo序列，Oligo-F和Oligo-R序列如下：Oligo-F：5’-TGTGTGGGGTGCTTCCTGTCCAAGC-3’SEQIDNO.4Oligo-R：5’-AAACGCTTGGACAGGAAGCACCCCA-3’SEQIDNO.5由生工生物公司合成以上Oligo-F和Oligo-R序列，然后将合成的Oligo-F和Oligo-R引物加水溶解至10μM。3按照百格CRISPRCas载体构建试剂盒说明书进行如下操作：步骤1：制备Oligo二聚体配制PCR反应体系18μLBufferAnneal，1μLOligo-F，1μLOligo-R混匀后，用PCR仪按照如下反应程序进行：95℃加热3分钟，之后以0.2℃秒的速度缓慢降至20℃，冷却复性之后即得到Oligo二聚体。步骤2：将以上Oligo二聚体构建至CRISPRCas载体在冰上配制反应体系2μLCRISPRCasVector、1μLOligo二聚体、1μLEnzymeMix，最后加水至10μL混匀后，室温反应1小时。步骤3:将以上反应体系转化大肠杆菌将大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1北京全式金生物技术有限公司从-80℃中取出，置于冰水浴中融化；再加入步骤2制备得到的5μL反应体系，轻轻混匀，冰上孵育30分钟不要晃动；之后置于42℃金属浴，热激60秒后，立刻置于冰水浴中，静置2分钟；再向离心管中加入500μL无抗LB液体培养基，37℃金属浴复苏10分钟；之后置于摇床，200rpm、37℃振荡培养1小时，使菌体复苏；吸取适当体积菌液，用无菌涂布棒在含有卡那霉素抗性的LB平板上轻轻涂匀，37℃倒置培养过夜。步骤4：提取质粒，获得GLW10敲除载体GLW10-BGK03。挑取以上LB平板上的单克隆摇菌提取质粒按照OMEGA质粒提取试剂盒说明书进行，将质粒送生工生物公司进行测序，得到测序正确的载体GLW10-BGK03见图1。实施例2GLW10过量表达载体构建利用Takara公司的反转录试剂盒，按照说明书操作，将500ng总RNA用于反转录合成cDNA。以该合成的cDNA为模板扩增GLW10基因的编码区序列SEQIDNO.1，扩增引物F和R分别带KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点下划线所示序列，序列如下所示：F：5’-CGGGGTACCATGGGGTGCTTCCTGTCCA-3’SEQIDNO.6R：5’-CGCGGATCCACCTCGCCAGCTATTTTG-3’SEQIDNO.7将以上扩增获得的GLW10基因编码区序列，利用T4连接酶，连接到植物表达载体pCAMBIA2300-35S-eGFP的KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，得到GLW10的过量表达载体pCAMBIA2300-35S-GLW10-eGFP见图2。实施例3GLW10敲除载体以及过量表达载体转化水稻日本晴1将以上构建好的GLW10敲除载体GLW10-BGK03以及过量表达载体pCAMBIA2300-35S-GLW10-eGFP的质粒分别转化农杆菌EHA105农杆菌转化方法的具体过程为：从-80℃冰箱取出EHA105感受态细胞，快速放手心化冻；加1μL质粒于1管感受态细胞中，冰上放置30分钟；液氮中冷冻2分钟；37℃水浴5分钟，溶化细胞；之后立即加入5倍体积的无抗LB培养基，于28℃、170rpm的条件下摇床培养2-3小时后；于7000rpm离心2分钟，再悬浮细胞于体积为100μL的LB培养基中；然后涂布在含利福平以及卡那霉素抗性的LB平板上，吹干，28℃培养2-3天。2将上述转化农杆菌之后的敲除载体和过量表达载体，利用农杆菌介导的方法，分别转化野生型水稻日本晴品种，获得GLW10的敲除以及过量表达转基因植株。实施例4GLW10敲除植株的鉴定及表型分析获得实施例3中的GLW10敲除转基因植株后，取叶片提取DNA，利用检测引物KO-F和KO-R扩增测序，确定敲除植株突变方式；引物KO-F和KO-R的具体序列如下：KO-F:5’-TGCTTCCCTACTACACACT-3’SEQIDNO.8KO-R:5’-GGAATGTACTAGCAGCAA-3’SEQIDNO.9一共获得3种不同突变方式的敲除突变体株系，命名为KO1，KO2和KO3见图3。考察敲除突变体各株系粒型表型，并与野生型日本晴WT进行对比，其结果见图4和图5。图4为GLW10敲除突变体株系与野生型日本晴WT的水稻粒型检测数据；其中，A为敲除突变体株系KO1、KO2、KO3和野生型日本晴WT的粒长对比结果；B为敲除突变体株系KO1、KO2、KO3和野生型日本晴WT的粒宽对比结果；C为敲除突变体株系KO1、KO2、KO3和野生型日本晴WT的千粒重对比结果。图5为GLW10敲除突变体株系与野生型日本晴WT的水稻籽粒示意图；其中，A为敲除突变体株系KO1、KO2、KO3与野生型日本晴WT水稻粒长示意图；B为敲除突变体株系KO1、KO2、KO3与野生型日本晴WT水稻粒宽示意图；由图4和图5说明，敲除GLW10后，水稻的粒长和千粒重明显下降，具体表现为粒长显著降低10.4％-12％，千粒重显著下降17.9％-21.5％；而粒宽则无明显变化。实施例5：GLW10过量表达植株的鉴定及表型分析获得实施例3中的GLW10过量表达植株后，分单株取叶片提取总RNA利用OMEGA公司的植物RNA提取试剂盒，按照说明书进行。利用Takara公司的反转录试剂盒，按照说明书操作，将500ng总RNA用于反转录合成cDNA。用引物qGLW10进行荧光定量PCR检测，以ACTIN引物作为内参。荧光定量检测引物序列如下：qGLW10-F：5’-GTATGGACCTTACAGCAGTA-3’SEQIDNO.10qGLW10-R：5’-GAGATGCTGAATACCAAGAAG-3’SEQIDNO.11ACTIN-F：5’-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3’SEQIDNO.12ACTIN-R：5’-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3’SEQIDNO.13对3个定量检测为过量表达的独立转基因株系OE1，OE2和OE3见图6，进行粒型考察，并与野生型日本晴进行对比，其结果见图7和图8。图7为GLW10过量表达植株OE1、OE2、OE3与野生型日本晴WT的水稻粒型检测数据；其中，A为过量表达植株OE1、OE2、OE3与野生型日本晴WT籽粒粒长检测数据；B为过量表达植株OE1、OE2、OE3与野生型日本晴WT籽粒粒宽检测数据；C为过量表达植株OE1、OE2、OE3与野生型日本晴WT籽粒千粒重检测数据。图8为GLW10过量表达植株与野生型日本晴WT的水稻籽粒示意图；其中，A为过量表达植株OE1、OE2、OE3与野生型日本晴WT籽粒粒长检测示意图；B为过量表达植株OE1、OE2、OE3与野生型日本晴WT籽粒粒宽检测示意图；由图7和图8说明，GLW10过表达能够提升水稻的粒长和千粒重，具体表现为，粒长增加的幅度与表达水平呈正相关，最终千粒重显著增加8.5％-12.6％，而粒宽无显著差异。由此，综上所述，GLW10基因能正调控水稻粒长和千粒重，可应用于增加水稻粒长和千粒重，提高水稻产量。序列表四川农业大学一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用13SIPOSequenceListing1.011539DNA水稻Oryzasativa1atggggtgcttcctgtccaagccggcgggggcgggtcccctcccgcccaacgacgccgcc60gcgctccccgccgacaaccccgcagatcccgaggcggcggccgcgaatggcggcgctgac120tccgcggcggccgacggcggcggcgacgacaaggacgccgccaagcgcgcggtcccggtg180ttcagggagttcggcctcgccgagctgcgcgccgccaccaagggcttcagcgccgacctc240atcgtctccgagagcggcgagaaggcccccaacgtcgtctaccgcggccgcctcgacggc300ggccgcctcatcgccgtcaagcgcttctcccgcctctcctggcccgacccgcagcagttc360ctcgcggaggcggccggggtggggaaggtgcgccacaagcgcctcgtcaacctcatcgga420tgctgcgccgagggcgacgagaggctgctcgtcgccgagtacatgcccaacgacaccctt480tccaagcatctcttccactgggataagcagcccttgccatgggaaatgcggttaagggtt540gcgtattacattgcgcaggcactcgatcactgcaatgccgagaaccgaaaaatctatcat600gacttgaatgcttatagagtactttttgatgaggaaggtgatcctcggctgtcaagtttt660ggactaatgaagaacagccgcgatgggaaaagttatagcactaatctggcttacaccccg720cctgagtttctacgaactggcagagtcatcgccgagagtgtgatatatagctatggaaca780gttcttttggatcttttgagtgggaagcacatacctcctagccatgcacttgatttgata840agagggaagaatatactgttgctcatggattcctccttagaagggcagtatgctaatgaa900gatgcttcaaaactagttgaccttgcgtcgaaatgcttgcaatttgaagcgagggacaga960cccaatataaagtatctcttgtcttctgttgggcctcttcagaagcaaaaggaggtagca1020tcacatgtgttgatgggtattacaaaagccacggcggtgttgccaactattctttctccc1080cttgggaaggcctgttccggtatggaccttacagcagtacatgatatattgctcaaaaca1140ggttacaaagatgaagaaggtgcagaaaatgagctgtcctttcaagaatggactcagcaa1200gtgcaagagatgctgaataccaagaagtttggtgacattgcatttagagacaaggatttc1260aagactgcaattgactactactccaagcttgttggaatgatgtcagtgccttcagccaca1320gtttttgcccggagaagtttctcctatttgatgaatgggcagtcagagcttgctctccgg1380gacgcaatgcaggcccaggtctgcatgcccgagtggccaactgccttctacctacaagcc1440cttgctctctcaaagctcggcatggaaactgacgcacaagatatgctaaacgatggagcc1500acttttgaggccaagaagcaaaatagctggcgaggttag15392512PRT水稻Oryzasativa2MetGlyCysPheLeuSerLysProAlaGlyAlaGlyProLeuProPro151015AsnAspAlaAlaAlaLeuProAlaAspAsnProAlaAspProGluAla202530AlaAlaAlaAsnGlyGlyAlaAspSerAlaAlaAlaAspGlyGlyGly354045AspAspLysAspAlaAlaLysArgAlaValProValPheArgGluPhe505560GlyLeuAlaGluLeuArgAlaAlaThrLysGlyPheSerAlaAspLeu65707580IleValSerGluSerGlyGluLysAlaProAsnValValTyrArgGly859095ArgLeuAspGlyGlyArgLeuIleAlaValLysArgPheSerArgLeu100105110SerTrpProAspProGlnGlnPheLeuAlaGluAlaAlaGlyValGly115120125LysValArgHisLysArgLeuValAsnLeuIleGlyCysCysAlaGlu130135140GlyAspGluArgLeuLeuValAlaGluTyrMetProAsnAspThrLeu145150155160SerLysHisLeuPheHisTrpAspLysGlnProLeuProTrpGluMet165170175ArgLeuArgValAlaTyrTyrIleAlaGlnAlaLeuAspHisCysAsn180185190AlaGluAsnArgLysIleTyrHisAspLeuAsnAlaTyrArgValLeu195200205PheAspGluGluGlyAspProArgLeuSerSerPheGlyLeuMetLys210215220AsnSerArgAspGlyLysSerTyrSerThrAsnLeuAlaTyrThrPro225230235240ProGluPheLeuArgThrGlyArgValIleAlaGluSerValIleTyr245250255SerTyrGlyThrValLeuLeuAspLeuLeuSerGlyLysHisIlePro260265270ProSerHisAlaLeuAspLeuIleArgGlyLysAsnIleLeuLeuLeu275280285MetAspSerSerLeuGluGlyGlnTyrAlaAsnGluAspAlaSerLys290295300LeuValAspLeuAlaSerLysCysLeuGlnPheGluAlaArgAspArg305310315320ProAsnIleLysTyrLeuLeuSerSerValGlyProLeuGlnLysGln325330335LysGluValAlaSerHisValLeuMetGlyIleThrLysAlaThrAla340345350ValLeuProThrIleLeuSerProLeuGlyLysAlaCysSerGlyMet355360365AspLeuThrAlaValHisAspIleLeuLeuLysThrGlyTyrLysAsp370375380GluGluGlyAlaGluAsnGluLeuSerPheGlnGluTrpThrGlnGln385390395400ValGlnGluMetLeuAsnThrLysLysPheGlyAspIleAlaPheArg405410415AspLysAspPheLysThrAlaIleAspTyrTyrSerLysLeuValGly420425430MetMetSerValProSerAlaThrValPheAlaArgArgSerPheSer435440445TyrLeuMetAsnGlyGlnSerGluLeuAlaLeuArgAspAlaMetGln450455460AlaGlnValCysMetProGluTrpProThrAlaPheTyrLeuGlnAla465470475480LeuAlaLeuSerLysLeuGlyMetGluThrAspAlaGlnAspMetLeu485490495AsnAspGlyAlaThrPheGluAlaLysLysGlnAsnSerTrpArgGly500505510319DNA人工序列ArtificialSequence3gggtgcttcctgtccaagc19425DNA人工序列ArtificialSequence4tgtgtggggtgcttcctgtccaagc25525DNA人工序列ArtificialSequence5aaacgcttggacaggaagcacccca25628DNA人工序列ArtificialSequence6cggggtaccatggggtgcttcctgtcca28727DNA人工序列ArtificialSequence7cgcggatccacctcgccagctattttg27819DNA人工序列ArtificialSequence8tgcttccctactacacact19918DNA人工序列ArtificialSequence9ggaatgtactagcagcaa181020DNA人工序列ArtificialSequence10gtatggaccttacagcagta201121DNA人工序列ArtificialSequence11gagatgctgaataccaagaag211221DNA人工序列ArtificialSequence12gactctggtgatggtgtcagc211320DNA人工序列ArtificialSequence13ggctggaagaggacctcagg20

权利要求：1.一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示的序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列。3.权利要求1或2所述GLW10基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求3所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能的氨基酸序列。5.一种包含权利要求1所述GLW10基因的质粒。6.一种包含权利要求1所述GLW10基因的重组表达载体。7.一种包含权利要求1所述GLW10基因的转基因细胞系。8.一种包含权利要求1所述GLW10基因的工程菌。9.权利要求1或2所述GLW10基因在改良水稻粒长和千粒重，提高水稻产量中的应用。

百度查询： 四川农业大学 一种控制水稻粒长和千粒重的GLW10基因及其编码的蛋白和应用