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申请/专利权人：内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司;内蒙古赛科星繁育生物技术(集团)股份有限公司

摘要：本发明公开了一种利用XistTale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法，利用结合于Xist第一内含子区的基于类转录激活效应物样Transcriptional‑activator‑likeeffectors,Tale的抑制性转录因子R6联合Oct4、Sox2、Klf4和c‑Myc之间的协同作用提高小鼠成纤维细胞向诱导性多能干细胞的诱导效率。而且获得的iPSCs具有典型的多能性干细胞特性，包括参与嵌合体小鼠的发育。该方法不仅积极推进了iPSCs的临床应用和研究，而且为研究如何获得并提高人、猪和牛等其它哺乳动物iPSCs提供了新的技术和理论基础。

主权项：1.一种利用XistTale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1细胞制备获取胎鼠的成纤维细胞MEF，经丝裂霉素C处理，作为诱导和培养iPSCs的饲养层；获取Oct4-GFPMEFs；2获得诱导性多能干细胞A、Oct4-GFPMEF细胞的电转染：当Oct4-GFPMEF细胞达到80％汇合度时，用0.5gL的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液于37℃消化5min，用等量的培养液中止消化，并对细胞计数，取1×106个细胞电转体系，以1300rpm离心5min；弃上清后用100μL电转液重悬细胞；再将细胞移入电转杯中，用电转仪进行电激；向电转杯中加入500μL提前预热的培养液，最后将细胞悬液接种到事先准备好的铺有步骤1中饲养层细胞的培养皿中进行培养；上述100μL电转液为包含1.0μgTRE-Oct4、2.0μgTRE-CKS、1.0μg转座酶HyBase、及1.0μgCAG-rtTA的Opti-MEM培养液；在此基础上，实验组另外添加2.0μg结合于Xist第一内含子的Tale抑制性转录因子R6，R6具体的结合位点如下：TTAAGTGTTATGGACAAGGASEQIDNO.1，GeneBank中参考基因序列号：NC_000086.7，而对照组不添加其它载体，或者添加2.0μg无特异性结合位点的Tale抑制性转录因子ConR；TRE-CKS中的CKS是指c-Myc、Klf4和Sox2；B、电转后iPSC的诱导及建系：电转染次日，培养液换为新鲜的添加2μgmLDox的M15培养液，并隔天换液；14天后，撤去Dox，换为2i培养液培养至第25-30天，至出现Oct4-GFP阳性克隆为止；第25天在荧光显微镜下镜检、计数，并拉制玻璃微针将表达Oct4-GFP阳性的细胞克隆挑出，用10μL移液枪将挑下的iPSC克隆转入提前加入30μL0.5gL的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液的圆底96孔板中，并于37℃消化8min，吹打数次后加入等量培养液终止消化，并接种于铺有步骤1中饲养层细胞的平底96孔板中于37℃、5％CO2培养箱中培养，直到形成典型的iPSC克隆。

全文数据：利用XistTaIe抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法技术领域[0001]本发明属生物技术领域，涉及一种利用XistTale抑制性转录因子联合0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc制备诱导性多能干细胞的方法。背景技术[0002]胚胎干细胞embryonicstemcell，ESCs是一类高度未分化细胞，具有发育全能性。在适当条件下可以无限增殖，并可以分化出成体动物组织和器官的所有细胞，如造血细胞、神经细胞、心肌细胞等。在动物克隆、转基因动物生产、疾病治疗、组织工程、再生医学、疾病机理和治疗研究、药物发现和评价等诸多领域均具有应用价值。但是伦理法律以及免疫排斥等问题一直制约着ESCs技术的进一步发展和应用。[0003]2006，日本科学家通过导入4种转录因子0ct4,Sox2，C-Myc，Klf4成功将鼠的体细胞重编程为ESCs状态，即诱导性多能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPSCs，随后，人的iPSCs也用相似的基因改造方法获得。iPSCs具有与ESCs类似的生物学特征，包括具有分化出成体动物组织和器官的所有细胞的能力，如神经前体细胞、功能性的成熟神经细胞，造血前体细胞、造血细胞、血管内皮细胞，分泌胰岛素的细胞，心肌细胞等。2009年，中国科学家周琪、曾凡一、高绍荣等利用iPSCs获得活体实验鼠，首次证明iPSCs与ESCs—样具有全能性。而且，由于iPSCs来源于自体细胞的重编程，较好地回避了长期以来围绕人类胚胎干细胞使用问题的伦理争论，同时也克服了异体移植存在的免疫排斥问题。这是科学史上的重大突破，在干细胞、发育生物学和医学研究领域中具有划时代意义。[0004]但人们对iPSCs技术的研究尚在初级阶段，其效率低是iPSCs应用面临的主要障碍之一。在各种诱导方法中，逆转录病毒载体诱导细胞重编程效率最高，也仅为0.01%左右，慢病毒、腺病毒更低。如何获得高效的iPSCs技术成为目前国际上干细胞研究领域的热点。[0005]iPSCs转化技术的核心是如何通过异源表达0ct4、Sox2等基因快速启动细胞内源性0ct4、Nanog等多能相关性基因的表达。在胚胎干细胞中，多能性调控因子0CT4、S0X2和NANOG等结合到Xist第一内含子区，以调控和维持XistRNA的低水平状态。最近研究发现，在Xist第一内含子区结合的因子还包括多能性调控因子TCF3和PRDM14,以及早期胚胎发育调控因子⑶X2等。而且有研究报道，Xist第一内含子在ESCs分化过程中具有增强子活性。作为多能性因子结合的关键区域，Xist第一内含子区的表观修饰状态可能与MEFs细胞的重编程息息相关，甚至可以提高iPSC的诱导效率。[0006]类转录激活效应物（Transcriptional-activator-likeeffectors,TALEs蛋白家族是来自于植物病原体-黄单胞杆菌的天然细菌效应蛋白。它与真核生物的转录因子相似，通过识别特异DNA序列来调节宿主基因转录，并促进细菌定植。人工体外合成的TALEs蛋白已经运用到基因工程的多个方面，包含具有基因组剪辑作用的类转录激活因子效应物核酸酶TALEN和起基因转录修饰和调控作用的Tale-dTFs等，其中Tale-dTFs包含抑制性效应因子（TALEbaseddesignertranscriptionRepressors,TaleR-dTF和激活性效应因子TALEbaseddesignertranscriptionactivators,TaleA-dTF，它们的TALE蛋白分别与抑制结构域如KRAB等和激活结构域如VP64相连接，最终通过在结合位点募集各种不同的转录调控因子而达到改变结合位点的表观遗传修饰状态并调控靶基因开关的目的。而且，Tale-dTFs已成功地应用于MEF细胞的重编程及干细胞的分化、转分化实验中。[0007]因此，利用结合于XiSt第一内含子的Tale抑制性转录因子建立高效获得iPSCs的方法，不仅积极推进了iPSCs的临床应用和研究，而且为研究如何获得并提高人、猪和牛等其它哺乳动物iPSCs提供了新的技术和理论基础。发明内容[0008]本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用XiStTale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法。[0009]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：[0010]1.细胞制备[0011]获取胎鼠的成纤维细胞mouseembryofibroblast，MEF，选择生长状态良好的MEF，丝裂霉素C处理，作为诱导和培养iPSCs的饲养层。[0012]获取0ct4-GFPMEFs，选择生长状态良好的0ct4-GFPMEF，用于电转染并制备iPSCs〇[0013]2.建立高效获得诱导性多能干细胞的方法[0014]在建立高效获得诱导性多能干细胞的方法中，利用含有四种转录因子0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的PiggyBac载体和XistTale抑制性转录因子转染。添加四种转录因子0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc和结合于Xist第一内含子区的Tale抑制性转录因子R6为实验组，含有四种转录因子0^4、3«2、1]^4、〇-]\^〇的单独处理或联合无特异性结合位点的：〇111?作为对照组，以确定不同组合转染0ct4-GFPMEFs获得iPSCs的效率，从而进一步确定高效获得iPSCs的方法。[0015]电转染按照常规方法进行:利用电穿孔法将四种转录因子0ct4、S〇X2、Klf4、c-Myc及XistTale抑制性因子R6转染入生长良好的0ct4-GFPMEFs;。第二天将培养基更换为添加Dox的iPSC诱导用液体培养基M15，直到克隆形成，对克隆并进行碱性磷酸酶检测或挑选形态上类似胚胎干细胞的克隆进行扩大培养，进而进行诱导性多能干细胞生物学特征检测。对于符合诱导性多能干细胞生物学特征的克隆，被确定为诱导性多能干细胞。[0016]显微镜下观察细胞形态变化。根据克隆形成情况，诱导25-30天后，确定各种方法获得iPSCs的效率;或对克隆进行机械传代以扩大培养，并进一步对获得的克隆进行生物学特征的鉴定。[0017]3.iPSCs生物学特征鉴定[0018]碱性磷酸酶AP活性检测，以确定获得的ESCs样克隆是否为AP染色阳性。[0019]免疫荧光检测获得的ESC样克隆中ESCs相关蛋白的表达，抗体分别为anti-0ct4和anti-Nanog。对于核蛋白，需要进行PBTPBS+0.l%Triton-100处理，以使相应的抗体进入细胞核中与相应抗原结合。[0020]通过体外和体内分化实验研究ESCs样克隆的分化潜能。体外分化利用拟胚体的形成以及拟胚体的自发分化形成各种细胞进行验证。体内分化潜能研究是将获得的ESC样克隆注射入NOD-SCID小鼠，观察畸胎瘤形成并分析畸胎瘤中三胚层分化情况。[0021]RT-qPCR检测获得的ESC样克隆中ESCs多能基因表达，如0ct4、Sox2、Nanog等。[0022]利用嵌合体制备技术研究ESC样细胞是否可以参与小鼠的正常发育，以确定ESC样细胞参与个体形成和发育的能力。[0023]本发明的有益效果是：该方法提高了小鼠iPSCs的诱导效率，不仅积极推进了iPSCs的临床应用和研究，也为研究如何获得并提高人、猪和牛等其它哺乳动物iPSCs提供了新的技术和理论基础。。附图说明[0024]图1是本发明具体技术流程；[0025]图2是本发明中XistTale抑制性效应因子R6的结构示意图；[0026]图3是本发明中所使用载体在Xist基因上的结合位点；[0027]图4是本发明中使用的0ct4-GFPMEFsA、B比例尺分别为500μπι和200μπι;[0028]图5是本发明中诱导得到的0ct4-GFP阳性iPSC克隆形态图Α、Β比例尺为200μπι;[0029]图6是R6提高了iPSCs的诱导效率图（相对倍数，Ρ〈0.0;[0030]图7是本发明中获得的iPSCs的生长情况图（Ρ15,比例尺为200μπι;[0031]图8是本发明中获得的iPSCs具有典型的干细胞特性图（A:iPSCs的碱性磷酸酶AP染色呈阳性，比例尺为200μπι;B:多能性因子0CT4和NANOG的免疫荧光染色呈阳性，比例尺为100ym;C:获得的iPSCs在体内具有向三胚层分化的能力（畸胎瘤实验），比例尺为100μm;D:获得的iPSCs在体外具有向三胚层分化的能力拟胚体实验），比例尺为100μπι;Ε:获得的iPSCs与ESCs的多能性相关基因的表达水平相近;F:获得的iPSCs参与了嵌合胚胎在体外的发育;G:获得的iPSCs参与了嵌合体小鼠的形成和发育）。具体实施方式[0032]下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：[0033]本发明利用XistTale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法，包括以下步骤：[0034]1细胞制备[0035]获取胎鼠的成纤维细胞MEF，经丝裂霉素C处理，作为诱导和培养iPSCs的饲养层；获取0ct4-GFPMEFs;[0036]2获得诱导性多能干细胞的方法[0037]利用含有四种转录因子0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的PiggyBac载体和XistTale抑制性转录因子转染;添加四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和结合于Xist第一内含子区的Tale抑制性转录因子R6为实验组，含有四种转录因子0^4、5«2、11€4、3-1^3的单独处理或联合无特异性结合位点的ConR作为对照组。[0038]具体地说，所述步骤2包括以下步骤：[0039]A、0ct4-GFPMEF细胞的电转染：当0ct4-GFPMEF细胞达到80%汇合度时，用0.5gL的胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液于37°C消化5min，用等量的培养液中止消化，并对细胞计数，取IXIO6个细胞电转体系，以1300rpm离心5min;弃上清后用IOOyL电转液重悬细胞;再将细胞移入电转杯SigmaZ706086-50EA中，选择电转仪Lonza，A-023进行电激；向电转杯中加入500yL提前预热的培养液，最后将细胞悬液接种到事先准备好的铺有步骤1中饲养层细胞的培养皿中进行培养；上述IOOyL电转液为包含I.OygTRE-0ct4、2·OygTRE-CKS、1·Oyg转座酶HyBase、及1·OygCAG-rtTA的Opti-MEM培养液；在此基础上，实验组另外添加2.Oyg结合于Xist第一内含子的Tale抑制性转录因子R6，而对照组不添加其它载体，或者添加2.Oyg无特异性结合位点的Tale抑制性转录因子ConR;TRE-CKS中的CKS是指c-Myc、Klf4和Sox2;[0040]B、电转后iPSC的诱导及建系：电转染次日，培养液换为新鲜的添加2ygmLDox的M15培养液，并隔天换液；14天后，撤去Dox，换为2i培养液培养至第25-30天，至出现0ct4-GFP阳性克隆为止;第25天在荧光显微镜下镜检、计数，并拉制玻璃微针将表达0ct4-GFP阳性的细胞克隆挑出，用IOyL移液枪将挑下的iPSC克隆转入提前加入30yL0.5gL的胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液的圆底96孔板中，并于37°C消化8min，吹打数次后加入等量培养液终止消化，并接种于铺有步骤1中饲养层细胞的平底96孔板中于37°C、5%C02培养箱中培养，直到形成典型的iPSC克隆。[0041]所述步骤B中利用结合于Xist第一内含子区的Tale抑制性转录因子R6联合四种转录因子0^4、5«2、11€4、3-1^3协同电转染1^?成为1?3：细胞，1?6具体的结合位点如下：TTAAGTGTTATGGACAAGGASEQIDN0.1，GeneBank中参考基因序列号：NC_000086.7〇[0042]本发明中使用了3种培养基，具体配制方法如下：[0043]1、小鼠胎儿成纤维细胞用液体培养基MlO的配制：[0044]含有10%胎牛血清、IX谷氨酰胺、IX非必需氨基酸、IX青链霉素的KnockoutDMEM0[0045]2、iPSCs诱导用液体培养基M15的配制：[0046]含有15%胎牛血清、IX谷氨酰胺、IX非必需氨基酸、IX青链霉素、0.ΙπιΜβ-巯基乙醇和l〇6UmlLIF的KnockoutDMEM。[0047]3、2iLIF培养液：[0048]含有N2、B27、1X谷氨酰胺、IX非必需氨基酸、IX青链霉素、0.ΙπιΜβ-巯基乙醇和LIF106Uml、PD1.0yM、CH3·ΟμΜ的DMEMF12。[0049]实施例1:载体的制备[0050]利用小鼠0ct4TaleR-dTF载体（ReprogrammingtopluripotencyusingdesignerTALEtranscriptionfactorstargetingenhancersGaoetal.,2013改造为特异性识别和结合Xist第一内含子区的TaleR-dTFR6，最终形成的R6为PB载体携带的由DoxycyclineDox依赖型启动子TRE驱动的表达载体XistTale抑制性效应因子R6的结构及其结合位点，见图2和图3。具体识别的DNA序列为TTAAGTGTTATGGACAAGGAGeneBank中参考基因序列号:NC_000086.7[0051]实施例2:饲养层细胞的制备[0052]取3-5代内长至80%汇合的MEFs，吸弃原培养液，加入终浓度为10mgL的丝裂霉素C的MEF培养液6mL于IOOmrn细胞培养皿处理细胞2.5h;弃去培养液，加5mL的D-PBS洗涤细胞，重复3次，完全去除丝裂霉素C，加入2mL0.5gL的胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液37°C孵育消化Imin后，倒置相差显微镜下观察细胞收缩变圆后，用手轻拍培养皿侧壁，细胞层层随之从皿底脱下，此时加入等量的MlO培养液终止消化;用电动移液器对皿壁和细胞悬液进行吹打混匀，收集细胞悬液至15mL离心管进行细胞计数，然后lOOOrmin离心3min后弃掉上清，用冻存液（10%?83+10%0130+80%110培养液）以2\106每管的浓度其冻存，待使用时对其进行解冻，每管解冻后可铺两个6孔板。[0053]实施例3:0ct4-GFPMEFs的建系[0054]性成熟的C57BL6J母鼠与携带0ct4-GFP的MFl，129sv公鼠按1«:2早）比例合笼，将见栓13.5d的孕鼠剖腹获取胎鼠，洗净后除去头部、四肢和尾部，洗净剪碎后用0.5gL的胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液于37°C水浴中消化20min，期间混匀几次;继续加入0.5gL的胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，于37°C水浴中消化20min。吹打混匀后加入培养液终止消化，IOOOrpm离心lOmin。弃掉上清，加适量培养液，反复吹打约10次，置于T25培养瓶中于37°：、5%〇2培养箱中培养0^4-6??腿?8生长状态见图4，达到80%汇合度后，进行1:3-1:5传代和培养，其它细胞进行原代冻存。[0055]实施例4:高效获得iPSCs方法的建立[0056]I、0ct4-GFPMEFs的电转染：当细胞达到80%汇合度时，用0.5gL的胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液于37°C消化5min，用等量的培养液中止消化，并对细胞计数，取IXIO6个细胞电转体系，以1300rpm离心5min。弃上清后用IOOyL电转液（内含l.OygTRE-0ct4、2.0y8丁1^-〇«、2.^81?6和1.^8转座酶办8386、及1.^8〇八6-忖了4的^衍-]\^]\1培养液）重悬细胞。再将细胞移入电转杯（Sigma中，选择电转仪Lonza，1程序A-023进行电激；向电转杯中加入500yL提前预热的培养液，最后将细胞悬液接种到事先准备好的培养皿中进行培养。在此基础上，实验组另外添加2.Oyg结合于Xist第一内含子的Tale抑制性转录因子R6，而对照组不添加其它载体，或者添加2.Oyg无特异性结合位点的Tale抑制性转录因子ConR;TRE-CKS中的CKS是指c-Myc、Klf4和Sox2,通过对比，添加R6的实验组诱导形成iPS克隆的效率明显高于对照组，其中，在雌性中实验组的诱导效率为对照组的3.5倍，在雄性中实验组的诱导效率为对照组的2.5倍。（见图6和诱导形成iPS克隆数目统计表）[0057]诱导形成iPS克隆数目统计表[0061]2、对转入载体的0ct4-GFPMEFs进行诱导和培养：电转后次日，培养液换为新鲜的添加2ygmLdoxcyclineDox的115培养液，并隔天换液。14天后，撤去0«，换为2;[培养液培养至第25-30天至出现0ct4-GFP阳性克隆为止，见图5。[0062]3、对0ct4-GFP阳性的iPSC克隆进行计数并挑取单克隆建系:第25天在荧光显微镜下镜检、计数并统计诱导效率见图6，拉制玻璃微针将表达0ct4-GFP阳性的细胞克隆挑出，用IOyL移液枪将挑下的iPSC克隆转入提前加入30yL0.5gL的胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液的圆底96孔板中，并于37°C消化8min，吹打数次后加入等量培养液终止消化，并接种于铺有滋养层细胞的平底96孔板中于37°C、5%C02培养箱中培养。[0063]4、iPSCs的传代和培养:利用DPBS将96孔板中重新形成的iPSC克隆清洗一遍，加入0.581的胰蛋白酶-0.02^^0了4消化液于37°：消化51^11，吹匀后终止消化，1300印111离心3min。弃上清并用培养液重悬接种于12孔板中进行培养iPSCs的生长状态见图7。[0064]实施例5:获得的iPSCs的多能性鉴定[0065]1、碱性磷酸酶染色AP染色）[0066]AP染液配制方法：①染液Sodiumnitritesolution1:50与染液FRV-alkalinesolution1:50按1:1混勾，室温避光2min;②染液naphthol-AS-BIalkalinesolution1:50，加入到Embryowater中。将配好的染液②加入到染液①中充分混勾。避光放置备用，现用现配。[0067]利用12孔板培养iPSCs至第5天时，弃培养液，加入DPBS洗一遍，弃DPBS后每孔加入300yL的4%PFA室温固定15min。弃PFA后用Embryowater洗2遍，弃Embryowater并加入提前配制好的AP染液300yL，室温避光放置30-60min。显微镜下观察拍照（iPSCs的AP染色成强阳性，见图8A。[0068]2、iPSCs的免疫荧光染色[0069]消化iPS细胞并计数，接种IXIO4个细胞于八孔板中，于培养箱中培养4天后进行免疫荧光染色。弃掉旧培养液，利用I3BS洗2遍，加入4%PFA室温固定15min;PBS洗3遍，每次5min;加入IFbuffer含1%BSA和0.1%Triton的DPBS，室温放置30min;加入I抗（Anti-Rat0CT4、Anti_MouseNAN0G4°C冰箱避光过夜。IFbuffer洗3遍，每次5min;加II抗DonkeyAnti-MouseIgGH+L、GoatAnti-RatIgG，室温避光放置Ihc3IFbuffer洗3遍，每次5min;PBS洗1遍;33342染剂避光染色3min;PBS洗1遍;拆开八孔板，滴加封片液，加盖玻片，指甲油涂抹四周边缘完成封片。于激光共聚焦显微镜下观察并进行拍照（iPSCs的免疫荧光染色呈阳性，见图8B。[0070]3、分化能力的检测[0071]①体内分化实验:将建系成功的iPSCs进行传代培养，直至饲养层细胞去除干净后，消化细胞并计数;收集IX1〇6_2XIO6个细胞至1.5mL离心管，1300rpm离心3min，弃上清，向离心管中加入500yL的DPBS重悬iPSCs，将细胞悬液装入ImL注射器。抓取一只免疫缺陷型小鼠，用酒精擦拭注射部位（后腿根部）后进行皮下注射（左右两侧后腿各注射250μυ。8周后形成明显的肿块组织，并将分离的肿块组织置于4%多聚甲醛中固定，制备组织切片后进行苏木精、伊红染色。最后，显微镜下观察、拍照记录并分析结果（iPSCs体内可分化为三胚层组织，见图8C。[0072]②体外分化实验:事先向IOOmm培养皿中加入IOmLroS。消化iPSCs并计数，调整细胞浓度为IXIO5个mL，并利用细胞悬液在皿盖上制备30yL的微滴。将皿盖小心翻过盖好并置于37°C、5%C02培养箱中悬空培养。第5-7天即可观察到细胞聚合形成小球状，即拟胚体。将形成的拟胚体转移到八孔板中，每孔添加500yLMlO培养液，置于37°C、5%C02培养箱中培养。期间进行观察并换液，待到第10天左右，可观察到拟胚体已向四周扩散分化，荧光显微镜下观察已无绿色荧光时进行免疫荧光染色：弃掉八孔板中的培养液，PBS洗2遍，弃去PBS后加入4%PFA室温放置15min进行固定;弃去4%PFA后用洗液IPBS+0.3%Triton清洗3遍，每次5min;弃掉洗液I，加入洗液IIPBS+1%BSA+0.3%Triton室温放置30min，加入一抗AFP、T及NCAM1于4°C冰箱孵育过夜。弃去一抗后用洗液I清洗3遍，每遍5min，并添加二抗CY3荧光标记的山羊抗兔IgG，避光放置Ih;洗液I清洗3遍，每遍5min;DI3BS清洗1遍，利用DAPI染色15minJPBS清洗1遍后，弃掉DPBS后，拆分八孔板，滴加封片液，加盖玻片，指甲油涂抹四周边缘完成封片。最后于激光共聚焦显微镜下观察并进行拍照（iPSCs体外具有分化为三胚层组织细胞的能力，见图8D。[0073]4、利用RT-qPCR对iPSCs进行多能性基因表达的检测[0074]①iPSCs总RNA提取:利用RNA提取试剂盒Cat.No.74104，QIAGEN完成iPSCs的总RNA提取。将收集到的RNA混匀后进行浓度与纯度的测定。[0075]②iPSCscDNA的制备:提前制冰，将试剂盒中的试剂在冰上融化。反转录反应体系为20yL，分为5yL和15yL两部分，5yL体系包括5yg的RNA，IyL的引物，然后用无核酸的水配制成5yL体系。70°C加热5min，然后迅速冰浴至少5min，微型离心机中离心IOs，冰上放置直至15yL体系加入。15yL体系包括GoScriptTM5X缓冲液4.OyUMgCl2最终浓度1.5-5.OmM2.5yL，dNTPI.OyL，核糖核苷酸酶抑制剂0.5yL，GoScriptTM反转录酶I.OyL，无核酸水6yL。将5yL体系与15yL体系混匀，于25°C孵育5min后，42°C孵育lh。[0076]③实时定量PCRReal-timequantitativePCR,RT-qPCR反应：将试剂盒中的试剂于冰上融化，样品使用前混匀后离心富集。qPCR所用到的引物见表1.1;qPCR的反应体系为20yL15yLMixI+5yLMixII，见表1.2，反应条件见表1.3。将样品加入到96孔板中并记录加样信息，封好透明膜后离心，离心完成后将电脑连接RT-qPCR仪Thermo，TCR0096，更改电脑IP地址，打开软件PikoRealsoftware，选择程序设定参数参数设置见表1.3，RT-qPCR反应完成后保存数据并进行分析见图8E。[0077]表1.1RT-qPCR所需引物信息（SEQIDNO.2-SEQIDNO.15[0086]5、嵌合体小鼠的制备[0087]①显微注射针的制备:利用水平微电极拉针仪P-97制作显微操作用针，选择程序为：P=500，HEAT=365，PULL=55，VEL=120，I1ME=100。拉制持卵针所使用的毛细玻璃管规格为：I.OOmm0.D.X0.58mmI.D，拉制注射针所使用的毛细玻璃管规格为：I.OOmm0.D.X0.78mmI.D。拉制完成后的持卵针口径为:90-120μπιO.D.X18-21ymI.D，注射针口径为：15-18μηιO.D.X1215ymI.D。[0088]②供体囊胚的获得:对ICR母鼠进行超排处理并合笼，第二天检栓，见栓当日视为0.5天;选取3.5天的小鼠囊胚用于嵌合体制备的供体胚胎:在无菌室将怀孕3.5天小鼠断颈处死，使其腹部朝上，酒精消毒，使用眼科剪和尖头镊子解剖小鼠，将小鼠子宫和输卵管剪下并去除脂肪和子宫系膜。将子宫和输卵管放在盛有M2操作液的60mm平皿中，然后使用尖头镊子和ImL注射器针头经断尖打磨处理分别对子宫和输卵管进行冲洗。使用毛细玻璃管酒精灯下徒手拉针，用口吸管将胚胎拣出，M2清洗两遍后，利用KSOM培养液继续清洗两遍，然后置于提前平衡好的KSOM培养液中培养、备用。[0089]③嵌合体小鼠的制备:选取核型正常的较低代次的小鼠iPSCs接种在铺有0.1%明胶的6孔板中培养，待细胞的汇合度达到70-80%时，用于嵌合体小鼠的制备。使用前弃培养液，DPBS洗一遍，0.58凡的胰蛋白酶-0.025^014消化液消化5111；[11，1300印1]1离心3111；[11弃上清，M2操作液重悬iPSCs，剩余的iPSCs置于4°C冰箱备用。取一IOOmm培养皿的皿盖，制作15μL的M2操作滴，上面覆盖矿物油。将消化好的细胞以及准备好的胚胎用口吸管移到操作滴中进行嵌合体制备。利用压电式破膜仪PiezoXpert将胚胎透明带打孔，注射针吸取约15个iPSCs，然后注入胚胎内。注射完成后的胚胎转移至KSOM培养液中，部分胚胎体外培养，观察体外发育情况见图8F，部分胚胎2小时后用于胚胎移植。将2.5dpc的假孕母鼠腹腔注射麻醉，利用75%的酒精对背部皮毛进行消毒处理，利用眼科剪在其背部两侧分别剪开Icm开口，剪开体腔膜，用尖头镊子将其卵巢，输卵管和子宫拉出，将胚胎吸入口吸管，利用ImL注射器针头对其子宫进行穿孔，将吸入口吸管的胚胎吹入子宫中，每侧移植10枚胚胎，移植完成后利用手术缝合器将伤口夹好，放到加热板上待其苏醒后标记并放回鼠房，16-17天后小鼠出生，待小鼠长大后可观察到是否具有皮毛嵌合见图8G。[0090]以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

权利要求：1.一种利用XistTale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1细胞制备获取胎鼠的成纤维细胞MEF，经丝裂霉素C处理，作为诱导和培养iPSCs的饲养层;获取0ct4-GFPMEFs；2获得诱导性多能干细胞A、0ct4-GFPMEF细胞的电转染：当0ct4-GFPMEF细胞达到80%汇合度时，用0.5gL的胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液于37°C消化5min，用等量的培养液中止消化，并对细胞计数，取IXIO6个细胞电转体系，以1300rpm离心5min;弃上清后用IOOyL电转液重悬细胞;再将细胞移入电转杯中，用电转仪进行电激；向电转杯中加入500yL提前预热的培养液，最后将细胞悬液接种到事先准备好的铺有步骤1中饲养层细胞的培养皿中进行培养;上述IOOyL电转液为包含l.OygTRE-0ct4、2.0ygTRE-CKS、1.0yg转座酶HyBase、及l.OygCAG-rtTA的Opti-MEM培养液;TRE-CKS中的CKS是指c-Myc、Klf4和Sox2;B、电转后iPSC的诱导及建系：电转染次日，培养液换为新鲜的添加2ygmLDox的M15培养液，并隔天换液；14天后，撤去Dox，换为2i培养液培养至第25-30天，至出现0ct4-GFP阳性克隆为止;第25天在荧光显微镜下镜检、计数，并拉制玻璃微针将表达0ct4-GFP阳性的细胞克隆挑出，用IOyL移液枪将挑下的iPSC克隆转入提前加入30yL0.5gL的胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液的圆底96孔板中，并于37°C消化8min，吹打数次后加入等量培养液终止消化，并接种于铺有步骤1中饲养层细胞的平底96孔板中于37°C、5%C02培养箱中培养，直到形成典型的iPSC克隆。2.根据权利要求1所述的利用XistTale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述电转杯为318!1^2706086-5^4，电转仪采用1^〇1^，mNucIeofector®.程序a-023进行电激。

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