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申请/专利权人：南京林业大学

摘要：本发明提供了一种TrxA‑Defensin融合蛋白、制备方法及其进一步制备得到的防御素蛋白和应用，涉及基因工程技术领域。所述TrxA‑Defensin融合蛋白由Trx蛋白与防御素蛋白融合形成。本发明借助于蛋白融合技术，将防御素蛋白基因与Trx基因，即一种氧化还原蛋白thioredoxin基因融合在一起，使防御素蛋白以融合蛋白的形式进行表达。经试验验证，本发明TrxA‑Defensin融合蛋白表达含量较高，同时由其进一步制得的防御素蛋白抗菌效果强、抗菌活性稳定，具有很好的工业应用前景。本发明所述TrxA‑Defensin融合蛋白及其进一步制得的防御素蛋白可广泛应用于制备抗细菌和真菌的药物之中。

主权项：1.一种TrxA-Defensin融合蛋白在制备抗细菌和真菌活性药物中的应用；所述细菌包括大肠杆菌和农杆菌；所述真菌包括黑曲霉菌、链格孢菌、毛霉菌、杨盘单格孢菌、根霉菌和粗糙链孢菌；其中，所述融合蛋白由Trx蛋白与防御素蛋白融合形成；所述TrxA-Defensin融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；所述防御素蛋白由毛果杨防御素基因表达得到，所述毛果杨防御素基因如SEQIDNo.4所示，所述防御素蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。

全文数据：TrxA-Defensin融合蛋白、制备方法及其进一步制备得到的防御素蛋白和应用技术领域本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种TrxA-Defensin融合蛋白、制备方法及其进一步制备得到的防御素蛋白和应用。背景技术当今社会随着抗生素的大量应用，致病菌耐药性问题已经成为医学研究的热题。如何筛选获得使得致病菌不会产生耐药性抗生素类药物是当代工作者探索的方向。随着近年来对防御素的研究发现，防御素defensin以其独特的作用机理和分子特性成为有望替代传统抗生素的理想药物。要将防御素应用到生产实践，还需要解决许多问题，其中最主要的问题就是如何大量获取有功能活性的防御素蛋白，一般获得防御素蛋白有三种方法：1直接从天然动植物或微生物组织细胞中提取防御素蛋白；2根据防御素蛋白的氨基酸组成直接化学合成并根据相关蛋白修饰运用化学方法进行体外修饰；3运用基因工程方法表达防御素蛋白。一般在没有基因工程出现的时期，通常采用直接提取的方法。虽然直接提取可以获得便宜、安全、可靠的防御素蛋白，而且最早研究与发现抗菌肽往往采用生物提取的方法，但由于抗菌肽在动植物体内含量极微，因而天然提取抗菌肽往往杂质较多、提取率较低、费时长、工艺复杂，因此成本相对较高，无法实现大规模生产，这也成为制约含防御素的抗菌肽进入实际应用的最大障碍。化学合成的方法虽然在生产上行得通，但是运用于产业化并不现实，特别是费用昂贵、对长链肽合成的低效率和抗菌活性不稳定的问题，使得其应用也受到了限制，上述两种方法均不及通过基因工程在体外表达的发展潜力。因此，研究开发出一种利用基因工程的方法生产大量且具有活性的含有防御素蛋白的活性抗菌肽具有极大的商业意义，变得十分必要和迫切。有鉴于此，特提出本发明。发明内容本发明的第一目的在于提供一种TrxA-Defensin融合蛋白，所述所述融合蛋白由Trx蛋白与防御素蛋白融合形成。经试验验证，本发明TrxA-Defensin融合蛋白表达含量较高，同时由其进一步制得的防御素蛋白抗菌效果强，具有很好的工业应用前景。本发明的第二目的在于提供一种所述TrxA-Defensin融合蛋白的制备方法，该方法采用重组DNA技术制备得到TrxA-Defensin融合蛋白，该方法具有提取制备效率高、制得的融合蛋白抗菌活性稳定，同时经济性强，适宜于大规模工业生产的优点。本发明的第三目的在于提供防御素蛋白由上述TrxA-Defensin融合蛋白经肠激酶酶切获得，防御素蛋白抗菌效果强，具有很好的工业应用前景。本发明的第四目的在于提供一种防御素蛋白的应用，所述防御素蛋白可广泛应用与抗细菌和真菌活性中。本发明提供的一种TrxA-Defensin融合蛋白，所述融合蛋白由Trx蛋白与防御素蛋白融合形成；所述TrxA-Defensin融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。进一步的，所述防御素蛋白为植物防御素蛋白，所述防御素蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；优选的，所述植物防御素蛋白由毛果杨防御素基因表达得到，所述毛果杨防御素基因如SEQIDNo.4所示。进一步的，所述TrxA-Defensin融合蛋白为可溶状态。本发明提供的一种TrxA-Defensin融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：首先制备包含防御素蛋白基因和Trx基因的重组DNA，随后将重组DNA分子转化受体细胞，培养获得TrxA-Defensin融合蛋白。进一步的，所述受体细胞为产生融合蛋白的细菌。进一步的，所述制备方法具体包括以下步骤：a：首先提取毛果杨的总RNA并逆转率为第一链cDNA，并以第一链cDNA为模板进行PCR扩增，其上游引物序列如SEQIDNo.5所示，下游引物序列如SEQIDNo.6所示，得到毛果杨防御素基因；b：将步骤a得到的毛果杨防御素基因用PCR的方法引入限制性内切酶BamHI和NotI的酶切位点，其上游引物序列如SEQIDNo.7所示，下游引物序列如SEQIDNo.8所示；随后将回收的PCR产物与PET-32a质粒载体用BamHI和NotI两种限制性内切酶进行酶切；然后在T4DNALigase连接酶的作用下，连接质粒载体和基因，得到重组DNA分子；c：将重组DNA分子转化感受态细菌，培养获得TrxA-Defensin融合蛋白。更进一步的，所述步骤c中的细菌为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21DE3。进一步的，所述制备方法还包括将融合蛋白进行分离纯化的步骤；优选的，所述分离纯化步骤中使用Ni+-NTA纯化树脂柱分离清除杂蛋白。本发明提供的一种防御素蛋白，所述防御素蛋白由上述TrxA-Defensin融合蛋白经肠激酶酶切获得。本发明提供的一种上述防御素蛋白在制备抗细菌和真菌活性药物中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的TrxA-Defensin融合蛋白，所述融合蛋白由Trx蛋白与防御素蛋白融合形成。本发明借助于蛋白融合技术，将防御素蛋白基因与Trx基因，即一种氧化还原蛋白thioredoxin基因融合在一起，使防御素蛋白以融合蛋白的形式进行表达。经试验验证，本发明TrxA-Defensin融合蛋白表达含量较高，同时由其进一步制得的防御素蛋白抗菌效果强、抗菌活性稳定，具有很好的工业应用前景。本发明提供的TrxA-Defensin融合蛋白的制备方法，首先制备包含防御素蛋白基因和Trx基因的重组DNA，随后将重组DNA分子转化受体细胞，培养获得TrxA-Defensin融合蛋白。上述制备方法采用重组DNA技术制备得到TrxA-Defensin融合蛋白，该方法具有提取制备效率高、制得的融合蛋白活性稳定，同时经济性强，适宜于大规模工业生产的优点。本发明提供的上述防御素蛋白，所述防御素蛋白由上述TrxA-Defensin融合蛋白经肠激酶酶切获得，可广泛应用于制备抗细菌和真菌活性的药物之中。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明中实施例2提供的PET-32a质粒载体的信息图谱；图2为本发明实施例3提供的融合蛋白TrxA-Defensin诱导表达后12％SDS-PAGE图；图3为本发明实施例3提供的融合蛋白TrxA-Defensin纯化12％SDS-PAGE凝胶电泳图和westernblot验证TrxA-Defensin融合蛋白图；图4为本发明实施例4提供的肠激酶酶切TrxA标签并获得Defensin的4-20％梯度SDS-PAGE电泳图；图5为本发明试验例1提供的经过肠激酶酶切后的防御素Defensin蛋白抗大肠杆菌K12D31和农杆菌EHA105抑菌圈图；图6为本发明试验例2提供的经过肠激酶酶切后Defensin蛋白抗真菌抑菌圈图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。根据本发明的一个方面，一种TrxA-Defensin融合蛋白，所述融合蛋白由Trx蛋白与防御素蛋白融合形成；所述TrxA-Defensin融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本发明提供的TrxA-Defensin融合蛋白，所述融合蛋白由Trx蛋白与防御素蛋白融合形成。本发明借助于蛋白融合技术，将防御素蛋白基因与Trx基因，即一种氧化还原蛋白thioredoxin基因融合在一起，使防御素蛋白以融合蛋白的形式进行表达。经试验验证，本发明TrxA-Defensin融合蛋白表达含量较高，同时由其进一步制得的防御素蛋白抗菌效果强、活性稳定，具有很好的工业应用前景。所述TrxA-Defensin融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。优选的，所述TrxA-Defensin融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。在本发明的一种优选实施方式中，所述防御素蛋白为植物防御素蛋白，所述防御素蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；作为一种优选的实施方式，上述防御素蛋白为植物防御素蛋白。在1990年由Mendez等从小麦、大麦种子首先分离得到植物防御素蛋白，用NMR光谱法测定其三维结构，发现与哺乳动物和昆虫防御素相似，均具有很好的杀菌和抗病毒的作用。优选的，所述植物防御素蛋白由毛果杨防御素基因表达得到，所述毛果杨防御素基因如SEQIDNo.4所示。在本发明的一种优选实施方式中，所述TrxA-Defensin融合蛋白为可溶状态。作为一种优选的实施方式，上述TrxA-Defensin融合蛋白为可溶状态。本发明借助于蛋白融合技术，把毛果杨防御素基因与TRX基因，即一种氧化还原蛋白thioredoxin基因融合在一起，使毛果杨防御素以融合蛋白的形式进行表达，结果该融合蛋白在通常的各种培养条件下均形成可溶性表达，表达含量较高、同时由其进一步制得的防御素蛋白具有非常好的抗菌活性。根据本发明的一个方面，一种TrxA-Defensin融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：首先制备包含防御素蛋白基因和Trx基因的重组DNA，随后将重组DNA分子转化受体细胞，培养获得TrxA-Defensin融合蛋白。目前常用的是重组DNA技术，一般包括四步：①获得目的基因；②与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；③用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；④对转化子筛选和鉴定。⑤对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。本发明提供的TrxA-Defensin融合蛋白的制备方法，首先制备包含防御素蛋白基因和Trx基因的重组DNA，随后将重组DNA分子转化受体细胞，培养获得TrxA-Defensin融合蛋白。上述制备方法采用重组DNA技术制备得到TrxA-Defensin融合蛋白，该方法具有提取制备效率高、制得的融合蛋白活性稳定，同时经济性强，适宜于大规模工业生产的优点。在本发明的一种优选实施方式中，所述受体细胞为产生融合蛋白的细菌。作为一种优选的实施方式，上述受体细胞为产生融合蛋白的细菌。优选的，所述细菌为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21DE3。在本发明的一种优选实施方式中，所述制备方法具体包括以下步骤：a：首先提取毛果杨的总RNA并逆转率为第一链cDNA，并以第一链cDNA为模板进行PCR扩增，其上游引物序列如SEQIDNo.5所示，下游引物序列如SEQIDNo.6所示，得到毛果杨防御素基因；b：将步骤a得到的毛果杨防御素基因用PCR的方法引入限制性内切酶BamHI和NotI的酶切位点，其上游引物序列如SEQIDNo.7所示，下游引物序列如SEQIDNo.8所示；随后将回收的PCR产物与PET-32a质粒载体用BamHI和NotI两种限制性内切酶进行酶切；然后在T4DNALigase连接酶的作用下，连接质粒载体和基因，得到重组DNA分子；c：将重组DNA分子转化感受态细菌，培养获得TrxA-Defensin融合蛋白。在上述优选实施方式中，所述步骤c中的细菌为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21DE3。在本发明的一种优选实施方式中，所述制备方法还包括将融合蛋白进行分离纯化的步骤；作为一种优选的实施方式，上述制备方法还包括将融合蛋白进行分离纯化的步骤，具体为：将培养获得TrxA-Defensin融合蛋白在冰上超声破碎，4℃，12000rpm，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过纯化树脂柱洗去杂蛋白，收集目的多肽透析过滤除菌后保存。优选的，所述分离纯化步骤中使用Ni+-NTA纯化树脂柱分离清除杂蛋白。作为一种优选的实施方式，上述分离纯化步骤使用Ni+-NTA纯化树脂柱分离清除杂蛋白。优选的，所述Ni+-NTA纯化树脂柱分离清除杂蛋白的洗脱步骤为：使用BindingBuffer平衡Ni+-NTA柱后，上样含可溶性重组多肽的上清，上样结束后，先用BindingBuffer进行初步洗脱，随后，再用Washingbuffer洗去蛋白，最后用Eluentbuffer洗脱目的蛋白。更优选的，所述BindingBuffer的组成为：20mmolLImidazole，0.5molLNaCl，20mmolLTrisHCl，pH8.0。Washingbuffer的组成为：50mmolLImidazole，0.5molLNaCl，20mmolLTrisHCl，pH8.0。Eluentbuffer的组成为：250mmolLImidazole，0.5molLNaCl，20mmolLTrisHCl，pH8.0。根据本发明的一个方面，一种防御素蛋白，所述防御素蛋白由上述TrxA-Defensin融合蛋白经肠激酶酶切获得。根据本发明的一个方面，一种上述防御素蛋白在制备抗细菌和真菌活性药物中的应用。本发明提供的上述防御素蛋白，所述防御素蛋白可广泛应用于制备抗细菌和真菌活性的药物之中。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1克隆杨树防御素基因：1应用RNA提取试剂盒Takara按照其操作手册提取毛果杨的总RNA，并通过2％琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度，紫外分光光度计测定其浓度。采用TakaracDNA逆转录试剂盒转录为第一链cDNA。2引物设计：根据NCBI公布的杨树防御素基因序列引物：Forwardprimer1序列：5’-ATGGAGATCAAGAGATCCTTTGG-3’序列如SEQIDNo.5所示，Reverseprimer1序列：5’-TTAACAAAGCTTGGTGCAAAAAC-3’序列如SEQIDNo.6所示；3PCR：利用逆转录所得的第一链cDNA为模板进行PCR，反应完成后将产物于1％琼脂糖凝胶中电泳分离，用胶回收试剂盒回收得到DNA条带，克隆入PETASY-T3载体，经含Amp抗生素50mgmL的琼脂糖平板筛选转化子，根据颜色反应挑出阳性克隆送往南京金斯瑞测序公司进行碱基序列测定，得到228bp的片段，将该序列与NCBI公布的序列比对一致，因此确定该序列为毛果杨防御素基因序列，序列如SEQIDNo.4所示所述毛果杨防御素基因序列序列如SEQIDNo.4所示中，1-27号碱基为该基因的5’UTR非编码区，28-256号碱基是该基因的全长编码序列ORF区，翻译75个氨基酸，257-614号碱基为该基因的3’UTR非编码区。上述PCR反应的反应体系为：10μmolL上、下游引物各2μL，10mmolLdNTP1μL，10×LaTaqbuffer5μL，cDNA模板3μL，LaTaq酶0.5μL，加ddH2O补足至50μL。上述PCR反应的反应程序为：95℃10min，95℃40s，58℃40s，72℃40s，35个循环，最后72℃延伸10min。实施例2重组DNA分子的构建：1将上述实施例1得到的毛果杨防御素基因用PCR的方法引入限制性内切酶BamHI和NotI的酶切位点，其上游引物序列如SEQIDNo.7所示，下游引物序列如SEQIDNo.8所示；2将回收后的PCR产物与PET-32a质粒载体用BamHI和NotI两种限制性内切酶进行酶切；然后在T4DNALigase连接酶的作用下，连接质粒载体和基因，得到重组DNA分子。如图1所示，图1为PET-32a质粒载体图谱。本实施例选择pET-32a质粒载体是利用其上游含有TRX基因序列；当然也可以把TRX基因用PCR方法插于到其他含有毛果杨防御素基因序列的载体上，可以同样实现毛果杨防御素基因融合蛋白表达克隆构建的目的。实施例3TrxA-Defensin融合蛋白的体外表达和纯化：将实施例2得到的重组DNA分子转化感受态大肠杆菌BL21DE3，获得含PET-32a-Defensin重组菌株，后从LB平板上挑取单菌落，挑取的单菌落在4毫升含有50微克毫升的LB液体培养基中过夜培养，过夜培养物随后按1:250的比例加入到2个500毫升的LB液体培养基中，在IPTG浓度1.0mmolL，16℃，110rpm的条件下诱导表达18小时收菌，冰上超声破碎表达菌体，4℃，12000rpm，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni+-NTA柱洗去杂蛋白，收集TrxA-Defensin融合蛋白透析过滤除菌后保存；上述Ni+-NTA纯化树脂柱分离清除杂蛋白的洗脱步骤为：使用BindingBuffer平衡Ni+-NTA柱后，上样含可溶性重组多肽的上清，上样结束后，先用BindingBuffer进行初步洗脱，随后，再用Washingbuffer洗去蛋白，最后用Eluentbuffer洗脱目的蛋白。其中，所述BindingBuffer的组成为：20mmolLImidazole，0.5molLNaCl，20mmolLTrisHCl，pH8.0。Washingbuffer的组成为：50mmolLImidazole，0.5molLNaCl，20mmolLTrisHCl，pH8.0。Eluentbuffer的组成为：250mmolLImidazole，0.5molLNaCl，20mmolLTrisHCl，pH8.0。如图2所示，图2为融合蛋白TrxA-Defensin诱导表达后12％SDS-PAGE图，其中M为Marker,泳道1为未诱导，泳道2-9为不同单克隆诱导表达。如图3所示，图3为融合蛋白TrxA-Defensin纯化12％SDS-PAGE凝胶电泳图和westernblot验证TrxA-Defensin融合蛋白图，其中：M为Marker,泳道1为诱导表达，泳道2为诱导表达沉淀，泳道3为诱导表达上清，泳道4为上样液，泳道5为上样液，泳道6为流出液，泳道7,8为洗脱液，泳道9为westernblot验证。实施例4将实施例3纯化得到的TrxA-Defensin融合蛋白于肠激酶10U存在下，在25℃下孵育16小时，将溶液重新加到含Ni-IDA树脂的镍柱上，除去其标记的TrxA。最终获得没有Trx标签的防御素蛋白。如图4所示，图4为肠激酶酶切TrxA标签并获得Defensin的4-20％梯度SDS-PAGE电泳图，其中：M为Marker,泳道1为纯化的TrxA-Defensin，泳道2为经过肠激酶酶切，泳道3为经NI柱洗脱流出液的防御素蛋白。试验例1实施例4制得的防御素蛋白在抗大肠杆菌和农杆菌中的活性鉴定：1防御素Defensin蛋白在抗大肠杆菌K12D31活性鉴定采用孔穴扩散法测定防御素防御素Defensin蛋白对大肠杆菌K12D31的抗菌活性。接种大肠杆菌K12D31于液体LB培养基，37℃220rpm培养6小时，按1％菌量加至融化的固体LB培养基中35-50℃，混匀后按30mL皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入按照倍比稀释将本发明实施例4制得的初浓度为96μgml防御素Defensin蛋白稀释成7份，并且每孔加入120μl防御素蛋白后置于37℃培养箱24小时，观察抑菌活性，结果见图5A，具有明显的抗大肠杆菌K12D31活性。其结果如图5A所示，图5A为经过肠激酶酶切后的Defensin蛋白抗大肠杆菌K12D31抑菌圈图，其中：C为120μl0.9％NaCl阴性对照,1为120μl96μgml防御素蛋白，2为120μl48μgml防御素蛋白，3为120μl24μgml防御素蛋白，4为120μl12μgml防御素蛋白，5为120μl6μgml防御素蛋白，6为120μl3μgml防御素蛋白，7为120μl1.5μgml防御素蛋白。2防御素Defensin蛋白在抗农杆菌EHA105活性鉴定采用孔穴扩散法测定防御素Defensin蛋白对农杆菌EHA105的抗菌活性。接种农杆菌EHA105于液体LB培养基，28℃220rpm培养12小时，按1％菌量加至融化的固体LB培养基中35-50℃，混匀后按30mL皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入按照倍比稀释将本发明实施例4制得的初浓度为96μgml防御素Defensin蛋白稀释成7份，并且每孔加入120μl防御素蛋白后置于28℃培养箱48小时，观察抑菌活性，结果见图5B，具有明显的抗农杆菌EHA105活性。其结果如图5B所示，图5B为经过肠激酶酶切后的Defensin蛋白抗农杆菌EHA105抑菌圈图，其中：C为120μl0.9％NaCl阴性对照,1为120μl96μgml防御素蛋白，2为120μl48μgml防御素蛋白，3为120μl24μgml防御素蛋白，4为120μl12μgml防御素蛋白，5为120μl6μgml防御素蛋白，6为120μl3μgml防御素蛋白，7为120μl1.5μgml防御素蛋白。试验例2实施例4制得的防御素Defensin蛋白抗真菌的活性鉴定：1抗黑曲霉Aspergillusniger活性鉴定采用孔穴扩散法测定防御素Defensin蛋白对黑曲霉Aspergillusniger的抗菌活性。接种Aspergillusnigers于液体土豆培养基，25℃180rpm培养6小时，按1％菌量加至融化的土豆培养基中35-50℃，混匀后按30mL皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入按照倍比稀释将本发明实施例4制得的初浓度为40μgml防御素Defensin蛋白稀释成7份，并且每孔加入120μl防御素蛋白后置于25℃培养箱72小时，观察抑菌活性，结果见图6A，具有明显的抗真菌活性。2抗链格孢菌AlternariaNee活性鉴定采用孔穴扩散法测定防御素Defensin蛋白对链格孢菌AlternariaNee的抗菌活性。接种AlternariaNee于液体土豆培养基，25℃180rpm培养6小时，按1％菌量加至融化的土豆培养基中35-50℃，混匀后按30mL皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入按照倍比稀释将本发明实施例4制得的初浓度为40μgml防御素Defensin蛋白稀释成7份，并且每孔加入120μl防御素蛋白后置于25℃培养箱72小时，观察抑菌活性，结果见图6B，具有明显的抗真菌活性。3抗毛霉菌Mucorcorymbifer.的活性鉴定采用孔穴扩散法测定防御素Defensin蛋白对毛霉菌Mucorcorymbifer.的抗菌活性。接种Mucorcorymbifer于液体土豆培养基，25℃180rpm培养6小时，按1％菌量加至融化的土豆培养基中35-50℃，混匀后按10mL皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入按照倍比稀释将本发明实施例4制得的初浓度为40μgml防御素Defensin蛋白稀释成7份，并且每孔加入120μl防御素蛋白后置于25℃培养箱72小时，观察抑菌活性，结果见图6C，具有明显的抗真菌活性。4抗杨盘单格孢菌Marssoninapopuli.的活性鉴定采用孔穴扩散法测定防御素TrxA-Defensin蛋白对杨盘单格孢菌Marssoninapopuli.的抗菌活性。接种Marssoninapopuli.于液体土豆培养基，25℃180rpm培养6小时，按1％菌量加至融化的土豆培养基中35-50℃，混匀后按30mL皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入按照倍比稀释将本发明实施例4制得的初浓度为40μgml防御素Defensin蛋白稀释成7份，并且每孔加入120μl防御素蛋白后置于25℃培养箱72小时，观察抑菌活性，结果见图6D，具有明显的抗真菌活性。5抗根霉菌Rhizopussp.的活性鉴定采用孔穴扩散法测定防御素TrxA-Defensin蛋白对根霉菌Rhizopussp.抗菌活性。接种Rhizopussp.于液体土豆培养基，25℃180rpm培养6小时，按1％菌量加至融化的土豆培养基中35-50℃，混匀后按30mL皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入按照倍比稀释将本发明实施例4制得的初浓度为40μgml防御素Defensin蛋白稀释成7份，并且每孔加入120μl防御素蛋白后置于25℃培养箱72小时，观察抑菌活性，结果见图6E，具有明显的抗真菌活性。6抗粗糙链孢菌Neurosporacrassa的活性鉴定采用孔穴扩散法测定防御素Defensin蛋白对粗糙链孢菌Neurosporacrassa的抗菌活性。接种Neurosporacrassa于液体土豆培养基，25℃180rpm培养6小时，按1％菌量加至融化的土豆培养基中35-50℃，混匀后按30mL皿铺于无菌一次性平皿。凝固后，在无菌条件下打孔，加入按照倍比稀释将本发明实施例4制得的初浓度为40μgml防御素Defensin蛋白稀释成7份，并且每孔加入120μl防御素蛋白后置于25℃培养箱72小时，观察抑菌活性，结果见图6F，具有明显的抗真菌活性。图6为试验例2提供的经过肠激酶酶切后Defensin蛋白抗真菌抑菌圈图。其中：C为120μl0.9％NaCl阴性对照,1为120μl100μgml防御素蛋白，2为120μl50μgml防御素蛋白，3为120μl25μgml防御素蛋白，4为120μl12.5μgml防御素蛋白，5为120μl6.5μgml防御素蛋白，6为120μl3.75μgml防御素蛋白，7为120μl1.85μgml防御素蛋白。综上所述，本发明提供的TrxA-Defensin融合蛋白，所述融合蛋白由Trx蛋白与防御素蛋白融合形成。本发明借助于蛋白融合技术，将防御素蛋白基因与Trx基因，即一种氧化还原蛋白thioredoxin基因融合在一起，使防御素蛋白以融合蛋白的形式进行表达。经试验验证，本发明TrxA-Defensin融合蛋白表达含量较高，融合蛋白经肠激酶酶切后获得的防御素Defensin蛋白抗菌效果强，具有很好的工业应用前景。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。SEQUENCELISTING南京林业大学TrxA-Defensin融合蛋白、制备方法及其进一步制备得到的防御素蛋白和应用46874613138PatentInversion3.51242PRTTrxA-Defensin融合蛋白1MetSerAspLysIleIleHisLeuThrAspAspSerPheAspThrAsp151015ValLeuLysAlaAspGlyAlaIleLeuValAspPheTrpAlaGluTrp202530CysGlyProCysLysMetIleAlaProIleLeuAspGluIleAlaAsp354045GluTyrGlnGlyLysLeuThrValAlaLysLeuAsnIleAspGlnAsn505560ProGlyThrAlaProLysTyrGlyIleArgGlyIleProThrLeuLeu65707580LeuPheLysAsnGlyGluValAlaAlaThrLysValGlyAlaLeuSer859095LysGlyGlnLeuLysGluPheLeuAspAlaAsnLeuAlaGlySerGly100105110SerGlyHisMetHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro115120125ArgGlySerGlyMetLysGluThrAlaAlaAlaLysPheGluArgGln130135140HisMetAspSerProAspLeuGlyThrAspAspAspAspLysAlaMet145150155160AlaAspIleGlySerGluPheMetGluIleLysArgSerPheGlyLeu165170175PhePheLeuLeuLeuIleValLeuAlaSerGlnGluValValValPro180185190ThrGluAlaArgValCysGlnSerGlnSerHisTyrPheLysGlyPro195200205CysAlaArgAspHisAsnCysAlaTrpValCysArgAsnGluGlyPhe210215220SerGlyGlyArgCysLysGlyPheArgArgArgCysPheCysThrLys225230235240LeuCys2729DNATrxA-Defensin融合蛋白2atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcg60gacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgcc120ccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaac180atcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctg240ctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttg300aaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcat360catcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaa420ttcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatg480gctgatatcggatccgaattcatggagatcaagagatcctttgggcttttcttcttgctc540ctcattgtcttggcttctcaagaggtggtggtgcctactgaggcaagggtttgccagtca600cagagccattattttaaaggcccatgtgctagggaccataactgtgcatgggtgtgcagg660aatgaaggtttctctgggggaagatgcaaagggttccgtcgccgctgtttttgcaccaag720ctttgttaa729375PRT毛果杨防御素蛋白3MetGluIleLysArgSerPheGlyLeuPhePheLeuLeuLeuIleVal151015LeuAlaSerGlnGluValValValProThrGluAlaArgValCysGln202530SerGlnSerHisTyrPheLysGlyProCysAlaArgAspHisAsnCys354045AlaTrpValCysArgAsnGluGlyPheSerGlyGlyArgCysLysGly505560PheArgArgArgCysPheCysThrLysLeuCys6570754600DNA毛果杨防御素基因4agcaaacgttttaagcaaactaaagacatggagatcaagagatcctttgggcttttcttc60ttgctcctcattgtcttggcttctcaagaggtggtggtgcctactgaggcaagggtttgc120cagtcacagagccattattttaaaggcccatgtgctagggaccataactgtgcatgggtg180tgcaggaatgaaggtttctctgggggaagatgcaaagggttccgtcgccgctgtttttgc240accaagctttgttaagttaagcaaagaaaatgcatcatgtgttaaggttgccaagcatgc300attttgacatgaaaaaagcactatcttaatatcctcttgttttttgttcaattagctgag360tatccataagaatgtcagcatcacttgtgttagcttgctcttcagctagacaacttgcta420gctttagaacctgctgctgatcgatgatgctggggttaatgtcaatgttggtttcgttat480gtaataataaactctcccttcttgttcgaggaagcattcttgtcacctaatttctggtgt540tctcaatggattcttgatgagaaaatgtgagtgatggcaaagagtccaaacacaacaaga600523DNA人工序列5atggagatcaagagatcctttgg23623DNA人工序列6ttaacaaagcttggtgcaaaaac23729DNA人工序列7cgggatccatggagatcaagagatccttt29839DNA人工序列8aaggaaaaaagcggccgcttaacaaagcttggtgcaaaa39

权利要求：1.一种TrxA-Defensin融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由Trx蛋白与防御素蛋白融合形成；所述TrxA-Defensin融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述的TrxA-Defensin融合蛋白，其特征在于，所述防御素蛋白为植物防御素蛋白，所述防御素蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；优选的，所述植物防御素蛋白由毛果杨防御素基因表达得到，所述毛果杨防御素基因如SEQIDNo.4所示。3.根据权利要求1所述的TrxA-Defensin融合蛋白，其特征在于，所述TrxA-Defensin融合蛋白为可溶状态。4.一种根据权利要求1～3任一项所述的TrxA-Defensin融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：首先制备包含防御素蛋白基因和Trx基因的重组DNA，随后将重组DNA分子转化受体细胞，培养获得TrxA-Defensin融合蛋白。5.根据权利要求4所述的TrxA-Defensin融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述受体细胞为产生融合蛋白的细菌。6.根据权利要求4所述的TrxA-Defensin融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：a：首先提取毛果杨的总RNA并逆转率为第一链cDNA，并以第一链cDNA为模板进行PCR扩增，其上游引物序列如SEQIDNo.5所示，下游引物序列如SEQIDNo.6所示，得到毛果杨防御素基因；b：将步骤a得到的毛果杨防御素基因用PCR的方法引入限制性内切酶BamHI和NotI的酶切位点，其上游引物序列如SEQIDNo.7所示，下游引物序列如SEQIDNo.8所示；随后将回收的PCR产物与PET-32a质粒载体用BamHI和NotI两种限制性内切酶进行酶切；然后在T4DNALigase连接酶的作用下，连接质粒载体和基因，得到重组DNA分子；c：将重组DNA分子转化感受态细菌，培养获得TrxA-Defensin融合蛋白。7.根据权利要求6所述的TrxA-Defensin融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤c中的细菌为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21DE3。8.根据权利要求4所述的TrxA-Defensin融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将融合蛋白进行分离纯化的步骤；优选的，所述分离纯化步骤中使用Ni+-NTA纯化树脂柱分离清除杂蛋白。9.一种防御素蛋白，其特征在于，所述防御素蛋白由权利要求1～3任一项所述的TrxA-Defensin融合蛋白经肠激酶酶切获得。10.一种根据权利要求9所述的防御素蛋白在制备抗细菌和真菌活性药物中的应用。

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