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申请/专利权人：青海民族大学;天津大学

摘要：本发明提供了一种CAGW多肽和TAT‑NLS多肽修饰的载基因复合物及其制备方法和应用，制备方法包括：制备聚乙二醇‑聚乙丙交酯共聚物mPEG‑b‑PLGA；制备聚乙丙交酯‑g‑聚乙烯亚胺共聚物PLGA‑g‑PEI；以PLGA‑g‑PEI为原料制备PLGA‑g‑PEI‑g‑CAGW共聚物；将PLGA‑g‑PEI‑g‑CAGW和mPEG‑b‑PLGA自组装制备靶向共聚胶束；向靶向共聚胶束中加入pDNA和TAT‑NLS，制得载基因复合物。本发明制得的载基因复合物对细胞有特异选择性，且具有很好的穿透能力和进核能力，且转染效率较高。

主权项：1.一种CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1采用mPEG作为大分子引发剂，辛酸亚锡作为催化剂，引发DL-LA和GA开环共聚，制得聚乙二醇-聚乙丙交酯共聚物mPEG-b-PLGA；2采用山梨醇作为引发剂，SnOct2甲苯溶液作为催化剂，引发DL-LA和GA开环共聚，制得聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA，然后将其羧基化后与PEI进行接枝反应，制得乳酸-羟基乙酸-g-聚乙烯亚胺共聚物PLGA-g-PEI；3将PLGA-g-PEI和三乙胺溶解于DMF中，在0℃条件下，向其中滴加二烯丙基氨基甲酰氯溶液，反应过夜，最后过滤，浓缩，冷冻干燥得到接有双键的产物；4将接有双键的产物溶于DMSO中，随后依次加入2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和CAGW的DMSO溶液，用紫外光照射10-15min，最后过滤，透析，冷冻干燥，制得PLGA-g-PEI-g-CAGW共聚物；其中，CAGW是Cys-Ala-Gly-Trp的简称；5将PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA分别溶于DMSO中，按照PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA质量比为2-4:0.8-1.2混合，然后加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液，搅拌，使其自组装形成PLGA-g-PEI-g-CAGWmPEG-b-PLGA靶向共聚物胶束；6将步骤5所得共聚物胶束与pDNA溶液混匀，静置20-40min，然后加入TAT-NLS溶液，混匀，超声振荡10-15s，最后静置20-40min，制得CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物；其中，步骤5所得物与pDNA的质量比为2-4:1-3；TAT-NLS上伯胺的摩尔数与pDNA上磷酸根的摩尔数比为0.1-30:1。

全文数据：一种CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物及其制备方法和应用技术领域本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物及其制备方法和应用。背景技术心血管疾病是由于内皮功能紊乱或损伤而发生，因此重建或修复血管内皮层对心血管疾病的治疗是一个有效的策略。许多研究将ECs细胞培养后种植在内皮层损伤的血管上，从而达到改善和修复内皮功能的目的。Wilson等用重组逆转录病毒将LacZ基因导入犬内皮细胞。细胞经LacZ基因转染后，种植在人造血管上植入犬大颈动脉，五周后扫描电镜结果证实内皮细胞完全包覆血管腔面。虽然ECs再生性强又位于血管内侧，基因表达产物可经血液循环分布全身。但是内皮细胞作为心血管疾病基因治疗中较理想的靶细胞，其固有的对外源基因的抑制以及对毒性的高敏感，被认为是较难转染的细胞之一。基因治疗技术的成功应用很大程度上取决于载体的发展，因此合成安全、高效的基因递送载体，是实现基因治疗应用于临床的首要前提。在过去几十年，阳离子聚合物这类基因载体具有安全性相对较好、可多次利用、制备过程较简单、易于修饰等优点。然而，由于其细胞毒性不耐受及较低的转染效率，使得阳离子聚合物的应用受到极大的限制。本课题组以前的研究中设计不同的可生物降解的阳离子聚合物作为基因载体，递送pEGFP-ZNF580pDNA质粒转染内皮细胞，以达到人工血管快速内皮化的目的。我们的研究结果证明不同的以聚乙烯亚胺PEI为基本结构的基因载体可以不同程度的促进内皮细胞增殖和迁移，但仍然存在转染效率低、细胞毒性较大的缺点。虽然靶向多肽REDV、CAG修饰后对ECs的转染效率有提高的表现。但依然存在载体进细胞困难；内涵体溶酶体逃逸困难；以及pDNA进入细胞核较难的问题。TAT多肽Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg因富含精氨酸片段而带有正电荷，可携载pDNA直接通过跨细胞膜进入细胞，且对细胞膜无损伤。核定位信号NLSPro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val是通过核膜上的核孔复合物NPC转运小分子物质40-60kDa进入细胞核。有研究证实NLS修饰PEI1.8kDa携带基因可以提升载体对细胞的转染效率。但是TAT和NLS在单独使用时都不能达到令人满意的转染效率。发明内容针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物及其制备方法和应用，可有效提高现有的载基因复合物进入细胞困难和转染效率低的问题。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物，其制备方法包括以下步骤：1采用mPEG作为大分子引发剂，辛酸亚锡作为催化剂，引发DL-LA和GA开环共聚，制得聚乙二醇-聚乙丙交酯共聚物mPEG-b-PLGA；2采用山梨醇作为引发剂，SnOct2甲苯溶液作为催化剂，引发DL-LA和GA开环共聚，制得聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA，然后将其羧基化后与PEI进行接枝反应，制得乳酸-羟基乙酸-g-聚乙烯亚胺共聚物PLGA-g-PEI；3将PLGA-g-PEI和三乙胺溶解于DMF中，在0℃条件下，向其中滴加二烯丙基氨基甲酰氯溶液，反应过夜，最后过滤，浓缩，冷冻干燥得到接有双键的产物；4将接有双键的产物溶于DMSO中，随后依次加入2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和CAGW的DMSO溶液，用紫外光照射10-15min，最后过滤，透析，冷冻干燥，制得PLGA-g-PEI-g-CAGW共聚物；其中，CAGW是Cys-Ala-Gly-Trp的简称；5将PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA分别溶于DMSO中，按照PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA质量比为2-4:0.8-1.2混合，然后加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液，搅拌，使其自组装形成PLGA-g-PEI-g-CAGWmPEG-b-PLGA靶向共聚物胶束；6将步骤5所得共聚物胶束与pDNA溶液按照混匀，静置20-40min，然后加入TAT-NLS溶液，混匀，超声振荡10-15s，最后静置20-40min，制得CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物；其中，步骤5所得物与pDNA的质量比为2-4:1-3；TAT-NLS上伯胺的摩尔数与pDNA上磷酸根的摩尔数比为0.1-30:1尤其是2-30:1。进一步地，步骤1的具体过程为：将mPEG、GA和DL-LA混匀，然后加入SnOct2甲苯溶液，密封，抽真空，通氮气，然后放入油浴锅中，于105-120℃反应22-26h，所得产物采用三氯甲烷溶解，正己烷沉出，最后进行真空干燥，制得；其中，mPEG、GA、DL-LA和SnOct2的摩尔比为0.35-0.45:6.5-7.5:22-23:0.08-0.12。进一步地，步骤2的具体过程为：于125℃的油浴中反应24h，制得PLGA共聚物；将PLGA共聚物溶于1,4-二氧六环中，在氮气环境下，加入三乙胺、DMAP和琥珀酸酐，于25℃油浴反应24-26h，制得羧基化的PLGA聚合物；将羧基化的PLGA聚合物溶于DMSO中，加入NHS搅拌2-3h，再加入含PEI的DMSO溶液，在氮气气氛下，反应24h，制得PLGA-g-PEI共聚物；其中，山梨醇、DL-LA、GA和SnOct2的摩尔比为0.1-0.2:31-32:4-5:0.08-0.12；PLGA共聚物和琥珀酸酐的摩尔比为0.05-0.1:3-4；羧基化的PLGA聚合物、NHS和PEI的摩尔比为0.004-0.005:0.1-0.15:0.08-0.12。进一步地，步骤3中二烯丙基氨基甲酰氯溶液的浓度为0.045molL，滴加时间控制在2h以内。进一步地，步骤4中接有双键的产物、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和CAGW的质量比为20-30:0.8-1.2:12-18。进一步地，步骤5中PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA的质量比为3:1。进一步地，步骤6中步骤5所得物与pDNA的质量比为3:2。进一步地，步骤6中TAT-NLS上伯胺的摩尔数与pDNA上磷酸根的摩尔数比为5:1。上述制得的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物可用于制备修复血管内皮细胞基因药物。本发明提供的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：本发明中TAT-NLS细胞穿膜肽TAT与核定位信号NLS结合功能性多肽，可以有效地将其携带的货物运送到HeLa和Cos7细胞系中，并且可以积极地表达外源DNA实现基因治疗目的。然而，TAT-NLS的弊端在于对不同细胞缺乏特异性。而选用的CAGW多肽对血管内皮细胞具有特异选择性，PEG可以提高生物相容性，聚乙烯亚胺与细胞穿膜肽TAT的共同作用，可以提高基因载体的内涵体逃逸能力，促进目的基因进入细胞质中，通过核定位信号NLS与核膜的相互作用，促进目的基因的核内在化，目的基因在内皮细胞中的转染效率也就随之增强。本发明将CAGW多肽接枝于载体的最外表面可以赋予载体具有靶向内皮细胞的功能，其可以通过受体-配体结合能力选择性地黏附于内皮细胞上。在此基础上，为了提高转染效率，本发明采用既具有穿透细胞能力又具有进核能力的TAT-NLS多肽与PLGA-g-PEI-g-CAGWPLGA-b-mPEGPCmP两亲聚合物复合胶束纳米粒协同缩和pDNA。研究表明TAT-NLS的加入增强了EA.hy926内皮细胞对TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物的摄取，TAT-NLS组合肽与PEI以及CAGW多肽的协同作用赋予载体具有多功能性，能够促进EA.hy926内皮细胞增殖。附图说明图1为PPmP非靶向基因复合物、PCmPpDNA靶向基因复合物的粒径和电位结果图。图2为TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物粒径和电位结果图。图3为不同NP摩尔比的基因复合物的凝胶琼脂糖电泳图。图4为EA.hy926内皮细胞在不同PEI浓度下的相对细胞活力。图5为EA.hy926内皮细胞被不同的基因复合物转染24h后的明场A1、B1、C1、D1和暗场A2、B2、C2、D2图。图6为EA.hy926内皮细胞12h迁移过程和12h时相对迁移面积结果图。图7为EA.hy926内皮细胞对不同基因复合物的细胞摄取结果。图8为TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物基因递送示意图。具体实施方式实施例1一种CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物，其制备方法包括以下步骤：1、聚乙二醇-聚乙丙交酯共聚物mPEG-b-PLGA命名为mP的合成b为block的缩写，代表嵌段聚合采用mPEG作为大分子引发剂，辛酸亚锡作为催化剂，引发DL-LA和GA开环共聚，具体过程为：称取1.956g0.3912mmolmPEG，0.8078g6.964mmol乙交酯GA，3.209g22.28mmolDL-型丙交酯DL-LA，放入干燥的聚合管中，加入SnOct2甲苯溶液0.4mL，0.25molL，密封，抽真空，通氮气，重复数次，然后放入油浴锅中，于110℃反应24h。所得产物采用三氯甲烷溶解，正己烷沉出，重复多次提纯产物，于25℃真空干燥，备用。2、聚乳酸-羟基乙酸-g-聚乙烯亚胺共聚物PLGA-g-PEI的合成g为graft的缩写，代表接枝共聚1采用山梨醇作为引发剂，SnOct2甲苯溶液作为催化剂，引发DL-LA和GA开环共聚，具体过程为：准确称取山梨醇0.025g，0.14mmol，DL-LA4.5341g，31.49mmol和GA0.5070g，4.37mmol加入干燥的Schlenk聚合管中。氮气吹扫除氧再加入SnOct2甲苯溶液0.4mL,0.25molL，密封后重复进行抽真空充氮气操作数次。浸入125℃的油浴中反应24小时。初产物溶于三氯甲烷中，在冰冷的正己烷中沉淀，重复溶解和沉淀操作过程提纯产物，在25℃下真空干燥48小时，收集白色产物，为PLGA共聚物。2称取PLGA共聚物2.0082g,0.06mmol溶于20mL1,4-二氧六环中，加入干燥和氮气吹扫的Schlenk聚合管中，并依次加入150μL三乙胺、DMAP0.4282g，3.50mmol和琥珀酸酐0.335g，3.35mmol；密封后重复进行抽真空充氮气操作数次，置于25℃油浴反应24-26小时，产物在冷己烷中沉淀。将沉淀后的产物重新溶于二氯甲烷中，然后用饱和的碳酸氢钠溶液、10％盐酸和饱和NaCl溶液将产物的二氯甲烷溶液分别洗涤3、4、3次。分离有机相，用无水硫酸镁干燥24小时后过滤。经蒸发浓缩后将有机相在冷正己烷中沉淀，得到羧基化的PLGA聚合物，然后在25℃下真空干燥至恒重。3在干燥的schlenk聚合管中将羧基化的PLGA聚合物0.15g，0.004mmol共聚物溶解于10mLDMSO中，加入NHS0.014g，0.123mmol25℃下搅拌2h，然后加入PEI10kDa，0.162g，0.09mmol的DMSO溶液。反应体系于25℃在氮气气氛下反应24h。然后将产物进行透析MWCO＝14kDa48小时，以去除DMSO溶液和未反应的PEI，将透析袋中的溶液冻干，获得PLGA-g-PEI共聚物。3、PLGA-g-PEI-g-CAGW靶向共聚物命名为PC的合成1在干燥的三颈烧瓶中将PLGA-g-PEI0.20g，0.012mmol和三乙胺Et3N28μL溶解在5.0mL的DMF中。在0℃下，将5mL二烯丙基氨基甲酰氯溶液0.045molL经滴液漏斗缓慢加入三颈烧瓶中，滴加时间控制在2.0小时，反应体系过夜，然后经过滤，浓缩，冷冻干燥得到接有双键的产物。2将步骤1所得的接有双键的产物25.0mg溶于DMSO5.0mL中，随后依次加入1.0mg2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮DMPA和15mgCAGWCys-Ala-Gly的DMSO溶液，然后将混合溶液用紫外光365nmUV-lamp照射反应10分钟，最后通过过滤、透析纯化和冻干得到PLGA-g-PEI-g-CAGW共聚物。3、PCmP、PPmP共聚物胶束及PCmPpDNA、PPmPpDNA基因复合物的制备分别配制5mgml的PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA的DMSO聚合物溶液，按质量比3:1共混，然后将2.0mL该共混的聚合物溶液缓慢滴加到含有5mL磷酸盐缓冲盐水PBS，pH＝7.4的锥形烧瓶中，不断的搅拌得到复合胶束溶液，自组装成PLGA-g-PEI-g-CAGWmPEG-b-PLGAPCmP靶向共聚物胶束，透析除去DMSO备用。同样的方法制备PLGA-g-PEImPEG-b-PLGAPPmP非靶向共聚物胶束，备用。按照不同NPPEI上伯胺的摩尔数与pDNA上磷酸根的摩尔数之比将pDNA溶液加入PCmP共聚物胶束制备靶向基因复合物PCmPpDNA。同样的方法制备非靶向基因复合物PPmPpDNA。4、TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物的制备将30μL0.2mgmL的PCmP溶液与20μL200μgmL的pDNA溶液混匀静置30分钟，然后按照不同的NP摩尔比TAT-NLS上伯胺的摩尔数与pDNA上磷酸根的摩尔数之比加入TAT-NLS0.1mgml多肽TAT-NLS多肽购买于上海吉尔生物化学有限公司，三者充分混匀超声10秒钟后静置30分钟，得到TAT-NLSpDNAPCmP四重复合物。对实施例所得的复合物进行如下测试：1、粒径和电位采用马尔文纳米粒度及zeta电位仪MalvernInstrument,Inc.,Worcestershire,UK分别测试PPmP非靶向复合物、PCmPpDNA靶向复合物和TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物的粒径和电位。不同NP摩尔比下PPmP非靶向基因复合物、PCmPpDNA靶向基因复合物的粒径和电位见图1；其中，图1中1为PPmP非靶向复合物和PCmPpDNA靶向基因复合物的粒径图，左边为PPmP非靶向复合物，右边为PCmPpDNA靶向基因复合物；图1中2为PPmP非靶向复合物和PCmPpDNA靶向基因复合物的电位图，左边为PPmP非靶向复合物，右边为PCmPpDNA靶向基因复合物。图1中柱形图从左到右分别代表NP摩尔比为2、5、10、15、20、25和30。图2为TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物的粒径和电位图。基因复合物的粒径和电位不仅影响载体的细胞毒性，对细胞的转染效率也同样重要。为了增加载体的生物相容性，研究表明在聚合物中引入mPEG链可以在形成胶束时屏蔽PEI表面的一部分正电荷，从而降低PEI的毒性。因此，本发明先将mPEG-b-PLGA分别与PLGA-g-PEI和PLGA-g-PEI-g-CAGW按体积比1:3共混在水中自组装形成胶束，按NP摩尔比为2、5、10、15、20、25和30包封pDNA形成PPmP非靶向复合物和PCmPpDNA靶向基因复合物。如图11所示，随着NP摩尔比的增加，PPmP非靶向复合物和PCmPpDNA靶向基因复合物，粒径从180nm降到70nm呈现出逐渐降低趋势，更有利于基因复合物被细胞摄取。由图12可知，随着NP摩尔比的增加，PPmP非靶向复合物和PCmPpDNA靶向基因复合物zeta电位逐渐增加，使得基因复合物zeta电位在细胞耐受的范围之内，更易于与细胞结合，被其摄取。当NP摩尔比为2时，PCmPpDNA靶向基因复合物的粒径为177.9±5.07nm，zeta电位为-1.366±1.58533mV，以这个NP摩尔比的PCmPpDNA靶向基因复合物与TAT-NLS多肽复合制备TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物。如图24所示，随着TAT-NLS加入量的增加，TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物粒径从315.2±16.3nm降低到166.4±9.3nm。开始加入TAT-NLS多肽基因复合物形成粒径较大的纳米粒，可能是由于TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物没有完全负载包封pDNA，导致了TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物团聚，随着NP摩尔比增加至pDNA质粒被完全负载包封，TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物形成的胶束粒径减小并逐渐趋于平稳。如图23所示，引入TAT-NLS多肽后TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物zeta电位表现出逐渐增大的趋势。加入TAT-NLS多肽后，TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物形成的zeta电位高于PCmPpDNA靶向基因复合物，这可能是由于TAT-NLS自身也带有正电荷所致。2、琼脂糖凝胶电泳实验通过琼脂糖凝胶电泳实验用来考察PPmP复合胶束、PCmP复合胶束及TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物复合胶束对pDNA质粒的压缩阻滞能力，具体实验步骤如下：按不同NP摩尔比0.51、21、51、101、201、301制备PPmPpDNA非靶向基因复合物、PCmPpDNA靶向基因复合物；并参照NP摩尔比210、212、215、2110、2115、2120制备TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物。以PPmP复合胶束为例，其他复合胶束对pDNA质粒的包封阻滞能力考察实验操作步骤同下。取该基因复合物10μL与0.5μgml溴化乙锭Ethidiumbromide，EB显色剂混匀卵育，10分钟后将基因复合物与染料的混合物加入0.8％的琼脂糖凝胶孔道中，于100V电压、1×TAE缓冲液中进行实验，实验持续30分钟。结束后在暗箱紫外分析仪中观察实验结果并拍照记录，考察胶束对pEGFP-ZNF580质粒的的包封效果，结果见图3，图3中A为PPmPpDNA非靶向基因复合物，B为PCmPpDNA靶向基因复合物，C为TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物。由图3可知，PPmPpDNA非靶向复合物胶束在NP摩尔比为51时完全包封pDNA，PCmPpDNA靶向复合物胶束在NP摩尔比为21时完全包封pDNA，而TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物胶束在NP摩尔比为212时就可以包封pDNA。TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物胶束显示出更强的负载质粒的能力，可能是由于TAT-NLS多肽本身也带有正电荷，TAT-NLS多肽引入使得胶束表面的zeta电位增大的缘故，从而能够在较低的NP摩尔比下完全包封pDNA质粒。3、细胞毒性实验以PEI10kDa为对照，采用MTT实验考察PPmPpDNA非靶向基因复合物、PCmPpDNA靶向基因复合物及TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物的细胞细胞毒性，具体实验步骤如下：将EA.hy926内皮细胞接种到96孔板1×104cellwell中，将细胞孵育至80-90％融合。然后，更换培养基为无血清细胞培养基，37℃、5％CO2下饥饿培养细胞12小时。将基因复合物溶液分别加入到新鲜的生长培养基10％FBSDMEM中混匀。将无血清培养基更换为含有基因复合物NP摩尔比为5，2μgpEGFP-ZNF580well的生长培养基。37℃，5％CO2下细胞在含有基因复合物的生长培养基中培养48小时后移除该培养基。向每孔中加入5mgmL的MTT溶液15μL，之后将96孔板重新放回细胞培养箱内37℃、5％CO2下继续孵育放置4小时，充分形成不溶性的甲瓒Formazan晶体。轻轻吸除每个孔内培养基后每孔加入150μL的DMSO溶液，轻微震荡溶解甲瓒晶体。最后利用酶标仪读取各孔在490nm波长下的吸收度值Opticaldensity，OD。利用如下公式计算细胞存活百分数Relativecellviability％：Relativecellviability公式1OD'：复合胶束或基因复合物实验组减去调零组的吸收度值；ODC'：矫正后的对照组平均吸收度值。通过MTT实验考察了PPmPpDNA非靶向基因复合物、PCmPpDNA靶向基因复合物和TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物的细胞毒性，结果如图4所示。图4中的每组柱形图从左到右分别为PPmPpDNA非靶向基因复合物、PCmPpDNA靶向基因复合物和TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物。当NP摩尔比为5时，以PEI10kDapDAN基因复合物为对照组，测定了不同PEI浓度1、3、6、9、12、15μgmL胶束和基因复合物对EA.hy926内皮细胞的毒性。EA.hy926内皮细胞经PPmPpDNA非靶向基因复合物转染后，细胞仍能仍保持较高的活力，与对照组相比PPmPpDNA非靶向基因复合物细胞毒性较低，可能是由于引入的PEG链段，PEG链段的屏蔽效应降低了基因复合物表面的正电荷从而降低了毒性。当引入CAGW多肽后，EA.hy926内皮细胞经PCmPpDNA靶向基因复合物转染后反而表现出细胞毒性增大的想象。这一现象可以认为是由于CAGW多肽对内皮细胞的特异性黏附功能，致使基因复合物在内皮细胞表面大量聚集，使细胞内外PEI浓度增加，进而表现出较高的细胞毒性。当NP摩尔比为2时，PCmPpDNA靶向基因复合物引入TAT-NLS多肽后，增大了TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物的zeta电位。但通过MTT实验我们发现，EA.hy926内皮细胞经TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物转染后，细胞活力仍然较高，且在较低的PEI浓度时3、6μgmL促进EA.hy926内皮细胞的生长。在所测试的PEI浓度范围内，细胞的相对存活率均高于80％。TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物的这一低毒性现象，可归结于引入的TAT-NLS多肽因由天然氨基酸分子构成赋予其的良好生物相容性。TAT-NLS多肽结构中富含精氨酸和赖氨酸序列，可以促进血管内皮生长因子VEGF165蛋白表达，从而有效地刺激ECs生长。4、体外转染实验将EA.hy926内皮细胞接种在6孔细胞培养板4×105cellwell上，培养12小时至细胞达到60％-70％的融合。EA.hy926内皮细胞无血清培养基饥饿培养12h，丢弃细胞碎片和代谢负产物。然后将新鲜配制的PPmPpDNA非靶向基因复合物、PCmPpDNA靶向基因复合物及TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物加入细胞孔内进行实验。观察24小时后绿色荧光图像，并拍照记录，结果见图5；其中，A为PPmPpDNA非靶向基因复合物转染细胞作为阳性对照；B为PCmPpDNA靶向基因复合物转染细胞；C为TAT-NLSpDNAPCmP四重基因复合物转染细胞；D为PEI10kDapDNA基因复合物转染细胞作为阴性对照。通过体外转染EA.hy926内皮细胞，考察PPmPpDNA非靶向基因复合物、PCmPpDNA靶向基因复合物和TAT-NLSpDNAPCmP四重基因复合物递送目的基因的效率。虽然有报道称亲水性PEG能够在材料表面形成水合屏蔽层，可以有效的抑制蛋白质和血小板在材料表面的吸附聚集。PEG屏蔽层能够显著提高基因载体的生物相容性，延长基因载体的循环时间。但如图5转染实验结果所示，A实验组不含CAGW多肽组分的PPmPpDNA非靶向基因复合物对EA.hy926内皮细胞具有较好的转染效果，但在MTT实验中发现其细胞毒性较高，细胞经其共培养后相对存活率较低。因此，可以判断此类基因复合物无法达到低毒高效转染EA.hy926内皮细胞的目的。与A实验组PPmPpDNA非靶向基因复合物相比，因为CAGW多肽具有特殊的ECs黏附能力，B实验组PCmPpDNA靶向基因复合物转染细胞确实提高了对EA.hy926内皮细胞的转染效率。TAT-NLSpDNAPCmP四重基因复合物是采取将质粒优先与PCmP复合胶束复合后再加入TAT-NLS多肽而制备的，PEI与pEGFP-ZNF580质粒的NP摩尔比固定为2，改变TAT-NLS多肽与pEGFP-ZNF580质粒的NP摩尔比从0到30，以这样的方式引入TAT-NLS，使得TAT-NLS多肽可以包裹在胶束的外层，有利于载体表面的正电荷与细胞膜表面的负电荷相互作用，可以提高TAT-NLSpDNAPCmP四重基因复合物对细胞膜的穿透能力。如图5C1、C2细胞转染结果所示，TAT-NLSpDNAPCmP四重基因复合物转染EA.hy926内皮细胞的转染效率显著提高，TAT-NLS多肽的加入确实能提高基因载体在EA.hy926内皮细胞中的传递和表达。这一现象正好体现了TAT-NLS多肽的特有的穿膜特性和靶向细胞核的特性有助于高效转染。PEI10kDapDNA基因复合物对照组虽然也有表达绿色荧光的细胞，但是明显少于测试组图5D1、D2，结合MTT实验结果，进一步说明对PEI进行疏水化改性，引入PEG链并采用特异性多肽对其进行功能化，不仅可以降低PEI的毒性还可以促进EA.hy926内皮细胞增殖。5、伤口愈合实验EA.hy926内皮细胞经PPmPpDNA非靶向基因复合物、PCmPpDNA靶向基因复合物及TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物转染后，利用无菌枪头在每孔细胞表面内轻轻地划出一条均匀的划痕而产生创面，观察EA.hy926内皮细胞的迁移过程的变化，并计算相对恢复面积。以PEI10kDapDNA基因复合物组为对照，本发明获取了0小时和12小时的细胞划痕创面图像，来验证细胞增殖和迁移的过程，划痕实验结果如图61所示。12h时的细胞的相对迁移面积如图62所示。图6中A为PPmPpDNA非靶向基因复合物转染细胞，B为PCmPpDNA靶向基因复合物转染细胞，C为TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物转染细胞，D为PEI10kDapDNA基因复合物转染细胞作为对照。以PEI10kDapDNA基因复合物组为对照，PPmPpDNA非靶向基因复合物、PCmPpDNA靶向基因复合物和TAT-NLSpDNAPCmP四重基因复合物实验组均呈现较明显的细胞迁移能力。没有引入CAGW功能多肽的PPmPpDNA非靶向基因复合物转染细胞虽然能提高EA.hy926内皮细胞的迁移能力，但是引入CAGW功能多肽后PCmPpDNA靶向基因复合物呈现了更大的迁移面积。在引入CAGW功能多肽的同时再与TAT-NLS多肽复合，TAT-NLSpDNAPCmP四重基因复合物转染细胞实验组相对迁移面积最大。EA.hy926内皮细胞经PPmPpDNA非靶向基因复合物、PCmPpDNA靶向基因复合物和TAT-NLSpDNAPCmP四重基因复合物转染12h后产生划痕创伤，相对迁移面积分别为48.9％±6.3、76.3％±7.2和83.6％±4.5。由此表明CAGW多肽功能化的PCmPpDNA靶向基因复合物有利于内皮细胞的迁移，CAGW多肽与TAT-NLS多肽两者协同作用可以进一步促进内皮细胞的迁移。6、细胞摄取实验首先用Cy5荧光染料标记pDNA，然后将负载被Cy5标记的基因的PPmPpDNA非靶向基因复合物、PCmPpDNA靶向基因复合物及TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物加入到EA.hy926内皮细胞中进行转染，4h后用PBS清洗细胞三次，除去多余的基因复合物及其他杂质。细胞经胰蛋白酶消化后反复多次离心。最后用流式细胞分析仪对基因复合物的细胞摄取进行分析，结果见图7。其中图71为平均荧光强度柱状图及细胞摄取率线形图，2为流式细胞术测定荧光强度及相应的细胞数目。图7中A为PPmPpDNA非靶向基因复合物转染细胞，B为PCmPpDNA靶向基因复合物转染细胞，C为TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物转染细胞，D为PEI10kDapDNA基因复合物转染细胞作为阳性对照，E为Cy5标记的寡核苷酸转染细胞。由图7可知，三种基因复合物测试组细胞摄取均高于99％，而平均荧光强度meanfluorescenceintensity，MFI较Cy5标记的寡核苷酸对照组有显著差异，分别为PPmPpDNA非靶向基因复合物1164.74±30.35、PCmPpDNA靶向基因复合物1208.05±24.69及TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物1619.75±35.336。PCmPpDNA靶向基因复合物比PPmPpDNA非靶向基因复合物更有利于细胞的摄取，这是由于CAGW靶向多肽的接枝引起的，可以进一步的说明CAGW多肽对内皮细胞的靶向性有利于基因复合物的细胞摄取。而引入TAT-NLS功能多肽后，平均荧光强度更进一步的增大。这表明TAT-NLS的引入，由于其赋予基因复合物具有细胞膜穿透功能而表现出最高的平均荧光强度。靶向多肽CAGW对EA.hy926内皮细胞的特异性黏附与TAT-NLS多肽对细胞膜穿透功能的协同作用。相比于PPmPpDNA非靶向基因复合物和PCmPpDNA靶向基因复合物，使得TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物更倾向于黏附在EA.hy926内皮细胞上，故对增强EA.hy926内皮细胞的转染是非常有利的。TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物基因递送示意图见图8所示。综上所述，本发明采用既具有穿透细胞能力又具有进核能力的TAT-NLS多肽与PLGA-g-PEI-g-CAGWPLGA-b-mPEGPCmP两亲聚合物复合胶束纳米粒协同缩和pDNA。首先将PCmP复合胶束与pDNA按不同的NP摩尔比复合，然后加入TAT-NLS多肽。研究表明，TAT-NLS的加入使得PCmPpDNA靶向基因复合物的粒径增大，由于TAT-NLS本身带正电，提高了TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物的zeta电位，增强了该四元基因复合缩合pDNA的能力。MTT结果表明TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物较PPmPpDNA非靶向基因复合物和PCmPpDNA靶向基因复合物具有较理想的细胞相容性。体外转染实验表明加入TAT-NLS多肽后能够稍稍提高细胞的转染效率，也可以明显的促进EA.hy926内皮细胞迁移。随后利用流式细胞术考察了PPmPpDNA非靶向基因复合物、PCmPpDNA靶向基因复合物和TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物的细胞摄取分析，结果表明TAT-NLS的加入增强了EA.hy926内皮细胞对TAT-NLSpDNAPCmP四元基因复合物的摄取，TAT-NLS组合肽与PEI以及CAGW多肽的协同作用赋予载体具有多功能性，能够促进EA.hy926内皮细胞增殖。

权利要求：1.一种CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1采用mPEG作为大分子引发剂，辛酸亚锡作为催化剂，引发DL-LA和GA开环共聚，制得聚乙二醇-聚乙丙交酯共聚物mPEG-b-PLGA；2采用山梨醇作为引发剂，SnOct2甲苯溶液作为催化剂，引发DL-LA和GA开环共聚，制得聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA，然后将其羧基化后与PEI进行接枝反应，制得乳酸-羟基乙酸-g-聚乙烯亚胺共聚物PLGA-g-PEI；3将PLGA-g-PEI和三乙胺溶解于DMF中，在0℃条件下，向其中滴加二烯丙基氨基甲酰氯溶液，反应过夜，最后过滤，浓缩，冷冻干燥得到接有双键的产物；4将接有双键的产物溶于DMSO中，随后依次加入2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和CAGW的DMSO溶液，用紫外光照射10-15min，最后过滤，透析，冷冻干燥，制得PLGA-g-PEI-g-CAGW共聚物；其中，CAGW是Cys-Ala-Gly-Trp的简称；5将PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA分别溶于DMSO中，按照PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA质量比为2-4:0.8-1.2混合，然后加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液，搅拌，使其自组装形成PLGA-g-PEI-g-CAGWmPEG-b-PLGA靶向共聚物胶束；6将步骤5所得共聚物胶束与pDNA溶液混匀，静置20-40min，然后加入TAT-NLS溶液，混匀，超声振荡10-15s，最后静置20-40min，制得CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物；其中，步骤5所得物与pDNA的质量比为2-4:1-3；TAT-NLS上伯胺的摩尔数与pDNA上磷酸根的摩尔数比为0.1-30:1。2.根据权利要求1所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，步骤1的具体过程为：将mPEG、GA和DL-LA混匀，然后加入SnOct2甲苯溶液，密封，抽真空，通氮气，然后放入油浴锅中，于105-120℃反应22-26h，所得产物采用三氯甲烷溶解，正己烷沉出，最后进行真空干燥，制得；其中，mPEG、GA、DL-LA和SnOct2的摩尔比为0.35-0.45:6.5-7.5:22-23:0.08-0.12。3.根据权利要求1所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，步骤2的具体过程为：将山梨醇、DL-LA和GA混合，在氮气环境下，加入SnOct2甲苯溶液，于125℃的油浴中反应24h，制得PLGA共聚物；将PLGA共聚物溶于1,4-二氧六环中，在氮气环境下，加入三乙胺、DMAP和琥珀酸酐，于25℃油浴反应24-26h，制得羧基化的PLGA聚合物；将羧基化的PLGA聚合物溶于DMSO中，加入NHS搅拌2-3h，再加入含PEI的DMSO溶液，在氮气气氛下，反应24h，制得PLGA-g-PEI共聚物；其中，山梨醇、DL-LA、GA和SnOct2的摩尔比为0.1-0.2:31-32:4-5:0.08-0.12；PLGA共聚物和琥珀酸酐的摩尔比为0.05-0.1:3-4；羧基化的PLGA聚合物、NHS和PEI的摩尔比为0.004-0.005:0.1-0.15:0.08-0.12。4.根据权利要求1所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，步骤3中二烯丙基氨基甲酰氯溶液的浓度为0.045molL，滴加时间控制在2h以内。5.根据权利要求1所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，步骤4中接有双键的产物、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和CAGW的质量比为20-30:0.8-1.2:12-18。6.根据权利要求1所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，步骤5中PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA的质量比为3:1。7.根据权利要求1所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，步骤6中步骤5所得物与pDNA的质量比为3:2；TAT-NLS上伯胺的摩尔数与pDNA上磷酸根的摩尔数比为2:1。8.根据权利要求1所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，步骤6中TAT-NLS上伯胺的摩尔数与pDNA上磷酸根的摩尔数比为5:1。9.采用权利要求1-8任一项所述的方法制得的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物。10.权利要求9所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物在制备修复血管内皮细胞基因药物中的应用。11.一种修复血管内皮细胞的基因药物，其特征在于，包括权利要求9所述的载基因复合物。

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