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申请/专利权人：新疆农业大学

摘要：本发明涉及一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法。其具体技术方案为：提取伊犁马基因组DNA；伊犁马ACTN3基因的PCR扩增；利用测序技术对所述伊犁马ACTN3基因进行序列测定；根据基因序列测定结果进行DNA序列比对，预测伊犁马比赛速度潜能。有益效果是：将分子生物学应用到运动马的选择与培育，具有简单、快捷、准确的优势，可以有效排除早期运动选材及选育过程中可能出现的干扰，能够在一定程度上加快运动马的培育进程，节省了时间和费用。

主权项：1.一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1:提取待预测伊犁马的基因组DNA；步骤2：将步骤1中提取的伊犁马的所述基因组DNA中的ACTN3基因进行PCR扩增；步骤3:利用测序技术对步骤2扩增后的伊犁马ACTN3基因进行序列测定；步骤4：根据步骤2中的基因序列测定结果与GenBank序列号:HQ005425进行DNA序列比对，预测伊犁马比赛速度潜能；所述步骤4中，当比对结果中，所述待测伊犁马的ACTN3基因G9764A、G9773A和G9783A突变位点可作为伊犁马1600m比赛速度性能的分子标记，ACTN3基因G9764A突变位点GG基因型赛马速度极显著高于AA基因型；G9773A突变位点GG基因型赛马速度显著高于AA基因型；G9783A突变位点AA基因型赛马速度极显著高于GG基因型；所述步骤4中，当比对结果中，所述待测伊犁马的G9789A和A9803G突变位点可作为伊犁马3600m比赛速度性能的分子标记，ACTN3基因G9789A和A9803G突变位点GG基因型赛马速度显著高于AA基因型速度。

全文数据：一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法技术领域[0001]本发明属于分子生物技术领域，尤其是涉及一种测伊犁马比赛速度潜能的分子生物学方法。背景技术[0002]赛马是一项集旅游、文化、体育、休闲娱乐等于一体的新兴产业，目前国内赛马发展势头良好，国内缺乏专门化运动马品种，大部分优质速度赛马还需从国外进口。伊犁马产于新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州，是我国自主培育的优良品种。伊犁马是通过以阿哈尔捷金、顿河马、奥尔洛夫、布琼尼马等引进轻型品种与哈萨克马杂交培育，并于1985年代通过专家组技术鉴定，正式命名为“伊犁马”。自上世纪90年代以来，为了提高伊犁马的专项性能，引进纯血马等轻型品种进行改良，其运动性能得到了较大的提升，具有力速兼备的特性，在国产运动马中具有较大的市场份额，并在国产马比赛中取得了优异的成绩。[0003]科学选材是竞技运动的重要组成部分，现代分子生物学的发展为运动选材提供了更多的科学依据。从分子水平上寻找决定运动性能的功能性基因，根据运动特性的不同而进行精准的选材，能够更好的发挥运动性能优势，从而在比赛中取得更好的成绩。将分子生物学应用到运动马的选择与培育，能够在一定程度上加快运动马的培育进程。[0004]针对现有技术要求，本发明提供了一种用ACTN3基因型预示和鉴定伊犁马速度潜能的分子标记方法分子生物学技术，即采用基因测序法检测ACTN3基因型，从而预示和鉴定伊犁马速度潜能。发明内容[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简单、快捷、准确的预测伊犁马比赛速度潜能的方法，结合序列比对结果，从基因特征上预测伊犁马比赛速度潜能，进而应用于速度赛伊犁马育种与早期运动选材。[0006]本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，包括以下步骤：[0007]步骤1:提取待预测伊犁马的基因组DNA;[0008]步骤2:将步骤1中提取的伊犁马的基因组DNA中的ACTN3基因进行PCR扩增；[0009]步骤3:利用测序技术对步骤2扩增后的伊犁马ACTN3基因进行序列测定；[0010]步骤4:根据步骤2中的基因序列测定结果与GenBank序列号:HQ005425纯血马序列进行DNA序列比对，预测伊犁马比赛速度潜能。[0011]所述步骤4中，比对结果中，待测伊犁马的ACTN3基因G9764A、G9773A和G9783A突变位点可作为伊犁马1600m比赛速度性能的分子标记，ACTN3基因G9764A突变位点GG基因型赛马速度极显著高于AA基因型；G9773A突变位点GG基因型赛马速度显著高于AA基因型；G9783A突变位点AA基因型赛马速度极显著高于GG基因型；比对结果中，待测伊犁马的G9789A和A9803G突变位点可作为伊犁马3600m比赛速度性能的分子标记，ACTN3基因G9789A和A9803G突变位点GG基因型赛马速度显著高于AA基因型速度。[0012]本发明的有益效果是:从分子水平上寻找决定运动性能的功能性基因，根据运动特性的不同而进行精准的选材，能够更好的发挥运动性能优势，从而在比赛中取得更好的成绩。将分子生物学应用到运动马的选择与培育，具有简单、快捷、准确的优势，可以有效排除早期运动选材及选育过程中可能出现的干扰，能够在一定程度上加快运动马的培育进程，节省了时间和费用。[0013]在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。[0014]进一步，待预测伊犁马的基因组DNA的提取:采集待测伊犁马颈静脉血液5mL，枸橼酸钠抗凝，_20°C保存;参照《分子克隆实验指南》，用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，-20°C保存。[0015]采用上述进一步方案的有益效果是:保证待预测伊犁马的基因组DNA提取的准确性，避免外界因素的干扰。[0016]进一步，所述步骤2中，PCR扩增步骤包括DNA变性、退火及延伸，参加所述PCR反应的物质主要有五种，即反应引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。[0017]采用上述进一步方案的有益效果是：使目的DNA得以迅速扩增，特异性强、灵敏度高、操作简便、省时。[0018]进一步，所述PCR反应引物序列为：[0019]上游引物F:5’-ATCATCAAACTTTAAGGCAGGGA[0020]下游引物R:5’-GTCACTTCCACTTGCTAGGTCTC[0021]引物扩增片段大小为701bp。[0022]采用上述进一步方案的有益效果是:有效地扩增模板DNA序列，增强PCR的特异性，增大PCR的成功几率。[0023]进一步，所述PCR扩增反应体系为25yL体系：上下游引物各0.5yL，dNTPIOmmol·L_1.M’O.SyUTaqBuffer2.5yL，Taq酶（5UCldH2O加至25yL。[0024]采用上述进一步方案的有益效果是:为PCR提供必要的物质，保证PCR产物的数量和质量。[0025]进一步，所述PCR扩增反应循环条件：95°C预变性3min，94°C变性30s，57°C退火45s，72°C延伸Imin，45个循环，72°C修复延伸IOmin，4°C保存。[0026]采用上述进一步方案的有益效果是:准确控制温度时间及保存温度，保证PCR过程有序进行，产物的特异性扩增。[0027]进一步，所述步骤4中，样品测序后用DNAMAN软件进行比对DNA序列。[0028]采用上述进一步方案的有益效果是:提高序列比对的准确性和可靠性。附图说明[0029]图1为本发明ACTN3基因G9764APCR产物测序峰图；[0030]图2为本发明ACTN3基因G9773APCR产物测序峰图；[0031]图3为本发明ACTN3基因G9783APCR产物测序峰图；[0032]图4为本发明ACTN3基因G9789APCR产物测序峰图；[0033]图5为本发明ACTN3基因A9803GPCR产物测序峰图。具体实施方式[0034]以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。[0035]如图1所示，ACTN3基因G9764APCR产物测序峰图。[0036]图2为ACTN3基因G9773APCR产物测序峰图。[0037]图3是ACTN3基因G9783APCR产物测序峰图。[0038]图4是ACTN3基因G9789APCR产物测序峰图。[0039]图5是ACTN3基因A9803GPCR产物测序峰图。[0040]实施例1[0041]下述实施例中若无特殊说明，所用的材料及试剂均可从商业途径购买。[0042]1、提取伊犁马基因组DNA[0043]实验马匹来自2016年及2017年新疆伊犁马常态化赛事的马匹，选用参加1600m赛事的31匹伊犁马和参加3600m赛事的30匹伊犁马。[0044]采集待测伊犁马颈静脉血液5mL，枸橼酸钠抗凝，-20°C保存；[0045]参照《分子克隆实验指南》，用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，_20°C保存。[0046]2、伊犁马ACTN3基因的PCR扩增[0047]根据NCBI公布的纯血马序列GenBank序列号:HQ005425，设计特异性引物，引物序列如下：[0048]上游引物F:5’-ATCATCAAACTTTAAGGCAGGGA[0049]下游引物R:5’-GTCACTTCCACTTGCTAGGTCTC[0050]引物扩增片段大小为701bp。[0051]?0財广增反应体系为25以1^体系：上下游引物各0.5以1^，1阶？（10111111〇1.171，]«_10.54L，TaqBuffer2.5yL，Taq酶（51]，以1710.2以1^，11!12〇加至254匕[0052]PCR扩增反应循环条件：95°C预变性3min，94°C变性30s，57°C退火45s，72°C延伸Imin，45个循环，72°C修复延伸IOmin，4°C保存。[0053]3、对伊犁马ACTN3基因进行序列测定[0054]将扩增产物送往上海生物工程技术有限公司进行测序，采用第一代测序技术。[0055]4、DNA序列比对，预测伊犁马比赛速度潜能[0056]根据基因序列测定结果，利用DNAMAN软件进行比对DNA序列，检测出突变位点：697644、697734、697834、697894和498036的基因型。本发明通过选取伊犁马六^^3基因697644、697734、697834、697894和498036突变位点的基因型来预示和鉴定短距离速度赛伊犁马速度性能。[0057]利用SPSS18.0软件对不同基因型伊犁马速度性能进行差异性分析，结果如下：[0058]表1:不同基因型与1600m速度ms的关系[0059][0060][0061]注：同列肩标中不同大写字母表示差异性极显著P〈0.01;不同小写字母表示差异性显著P〈〇.〇5[0062]其中G9764A、G9773A和G9783A突变位点可作为伊犁马1600m比赛速度性能的分子标记，可用于1600m速度赛伊犁马早期运动选择和选育，ACTN3基因G9764A突变位点GG基因型赛马速度极显著高于AA基因型;G9773A突变位点GG基因型赛马速度显著高于AA基因型；G9783A突变位点AA基因型赛马速度极显著高于GG基因型。也就是说，在待测伊犁马中，ACTN3基因G9764A突变位点为GG基因型和或者G9773A突变位点为GG基因型和或者G9783A突变位点为AA时，待测伊犁马具有1600m比赛速度的潜能，换言之，G9764A、G9773A和G9783A三个突变位点中任一个均可预测伊犁马是否具有1600m比赛速度的潜能。[0063]表2:不同基因型与3600m速度ms的关系[0064][0065]注：同列肩标中不同小写字母表示差异性显著P〈0.05[0066]G9789A和A9803G突变位点可作为伊犁马3600m比赛速度性能的分子标记，可用于3600m速度赛伊犁马早期运动选择和选育，ACTN3基因G9789A和A9803G突变位点GG基因型赛马速度显著高于AA基因型速度。也就是说，在待测伊犁马中，ACTN3基因G9789A突变位点为GG基因型和或者A9803G突变位点为GG基因型时，待测伊犁马具有3600m比赛速度的潜能，换言之，G9789A和A9803G两个突变位点中任一个均可预测伊犁马是否具有3600m比赛速度的潜能。[0067]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1:提取待预测伊犁马的基因组DNA;步骤2:将步骤1中提取的伊犁马的基因组DNA中的ACTN3基因进行PCR扩增；步骤3:利用测序技术对步骤2扩增后的伊犁马ACTN3基因进行序列测定；步骤4:根据步骤2中的基因序列测定结果与GenBank序列号：HQ005425进行DNA序列比对，预测伊犁马比赛速度潜能。2.根据权利要求1所述一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，所述步骤4中，当比对结果中，待测伊犁马的ACTN3基因G9764A、G9773A和G9783A突变位点可作为伊犁马1600m比赛速度性能的分子标记，ACTN3基因G9764A突变位点GG基因型赛马速度极显著高于AA基因型;G9773A突变位点GG基因型赛马速度显著高于AA基因型;G9783A突变位点AA基因型赛马速度极显著高于GG基因型。3.根据权利要求1所述一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，所述步骤4中，当比对结果中，待测伊犁马的G9789A和A9803G突变位点可作为伊犁马3600m比赛速度性能的分子标记，ACTN3基因G9789A和A9803G突变位点GG基因型赛马速度显著高于AA基因型速度。4.根据权利要求1所述一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，所述步骤1中，基因组DNA的提取:采集待测伊犁马颈静脉血液5mL，枸橼酸钠抗凝，-20°C保存；用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，-20°C保存。5.根据权利要求1所述一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，所述步骤2中，PCR扩增步骤包括DNA变性、退火及延伸，参加所述PCR反应的物质主要有五种，即反应引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。6.根据权利要求5所述一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，所述PCR反应引物序列为：上游引物F:5’-ATCATCAAACTTTAAGGCAGGGA下游引物R:5’-GTCACTTCCACTTGCTAGGTCTC引物扩增片段大小为701bp。7.根据权利要求5所述一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，？0財广增反应体系为25以1^体系：上下游引物各0.5以1^，1犯1310臟〇1.171，]«_10.5以1^9Buffer2.5yL，Taq酶（5U·yL_10.2yL，CldH2O加至25yL。8.根据权利要求5所述一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，PCR扩增反应循环条件:95°C预变性3min，94°C变性30s，57°C退火45s，72°C延伸Imin，45个循环，72°C修复延伸IOmin，4°C保存。9.根据权利要求1所述一种基于ACTN3基因预测伊犁马比赛速度潜能的方法，其特征在于，所述步骤4中，样品测序后用DNAMAN软件进行比对DNA序列。

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