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申请/专利权人：浙江大学
摘要：本发明提供了一种基于pCAG‑flox‑neo载体的高效稳定的定点整合基因敲入方法，具体步骤如下：1将pCAG‑STOP2载体双酶切；将合成的片段经连接至pCAG‑STOP2载体；2将合成的载体再次酶切后连入polyA‑loxP得到pCAG‑flox‑neo载体；3将能够被sgRNA识别的猪pH11位点的sgRNA序列以及PAM序列插入到T3promoter后，得到最终的基因敲入载体骨架pCAG‑floxP‑neo‑pH11；4将所需要的hKCNH2‑T618I及hmuPKD2片段通过PCR扩增，并通过一步克隆的方式插入到pCAG‑floxP‑neo‑pH11载体骨架中。本发明建立了一种高效、精准、操作简单同时可以敲除目的基因的方法，对于研究目的基因在哺乳动物或疾病模型中的作用具有重要科学意义。
主权项：1.一种基于pCAG-flox-neo载体的高效稳定的定点整合基因敲入方法，其特征在于，具体步骤如下：1首先将pCAG-STOP2载体用EcoRI和PACI双酶切；然后将合成的片段Ⅰ：PKGpromoter-neo-polyA-loxP经过EcoRI和PACI酶切后连接至pCAG-STOP2载体；2随后将步骤1合成的载体再次经EcoRI酶切后连入片段II：polyA-loxP得到pCAG-flox-neo载体；3最后，将能够被sgRNA识别的猪pH11位点的sgRNA序列GTTCCTGGAAGTTTAGATCA以及PAM序列GGG插入到T3promoter后，得到最终的基因敲入载体骨架pCAG-floxP-neo-pH11；4将所需要的hKCNH2-T618I及hmuPKD2片段通过PCR扩增，并通过一步克隆的方式将hKCNH2-T618I和hmuPKD2基因插入到pCAG-floxP-neo-pH11载体骨架中，得到pCAG-floxP-neo-pH11-hKCNH2-T618I和pCAG-floxP-neo-pH11-hmuPKD2质粒。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 浙江大学 一种基于pCAG-flox-neo载体的高效稳定的定点整合基因敲入方法
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