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申请/专利权人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所

摘要：本申请涉及与bm5突变体表型相关的突变基因鉴定、变异及其分子标记物。具体分为以下四个方面：本发明内容关注特定的天然存在的玉米突变体bm5，克隆了其突变基因BM5，该基因由于转座子（Mu元件和Ac元件）的插入在特定的玉米系中促成木质素成份变化的表型；本发明提供了该转座子鉴定的快速检测方法；4‑香豆酸:辅酶A连接酶（Zm4CL1）的酶活水平直接影响了玉米木质素组份和糖化效率；Zm4CL1可以作为木质素定向分子遗传育种的靶标基因之一，为今后的分子育种提供新的靶标，为定向分子遗传育种提供现实指导意义。

主权项：1.玉米4-香豆酰CoA连接酶基因Zm4CL1，其特征在于所述基因Zm4CL1的外显子区插入带有Mu转座子标签的SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或所述基因Zm4CL1的外显子插入带有Ac转座子标签的SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。

全文数据：玉米brownmidrib5（bm5）突变体的突变基因鉴定、变异及其分子标记物技术领域本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及与玉米红棕色叶脉突变体bm5相关的BM5基因突变位点Zm4CL1及其分子标记物，所述改变的基因促成玉米木质素组分的变化，进而提高玉米细胞壁消化率，涉及到禾本科玉蜀黍属BM5基因的应用。背景技术玉米（ZeamaysL.）属禾本科玉蜀黍属一年生C4草本植物，是粮食、动物饲料和工农业生物质能源原料的重要来源。植物细胞壁主要由木质素、纤维素和半纤维素组成，它们是决定生物质能源转化效率和牧草品质的重要因素。解析与玉米的木质素代谢途径相关的调控机制，改变木质素成份进而增加细胞壁消化率，对玉米的遗传育种具有重要的现实指导意义。木质素是一类苯丙烷类单体化合物聚合而成的多聚化学物，包括三种单体成份，分别为紫丁香基木质素（syringyllignin，S-木质素）、愈创木基木质素（guaiacyllignin，G-木质素）和对-羟基苯基木质素（hydroxy-phenyllignin，H-木质素）。木质素的生物合成主要分为以下四个步骤：（1）首先由苯丙氨酸经过脱氨基、羟基化以及甲基化等反应，生成羟基肉桂酸类化合物包括对-香豆酸（p-coumaric）、咖啡酸（caffeicacid）、阿魏酸（ferulicacid）、5-羟基阿魏酸（5-hydroxyferulicacid）和芥子酸（sinapicacid）；（2）羟基肉桂酸在4-香豆酸辅酶A连接酶（4-Coumarate:CoenzymeAligase，4CL）的催化下生成羟基肉桂酸酯酰辅酶A化合物，后续反应进入木质素特异的合成步骤；（3）羟基肉桂酸酯酰辅酶A在肉桂酰辅酶A还原酶（cinnamoylCoA-reductase，CCR）与肉桂醇脱氢酶cinnamylalcoholdehydrogenase，CAD或者芥子醇脱氢酶（sinapylalcoholdehydrogenase，SAD）催化的两步还原反应生成不同的木质素单体。植物中4CL家族成员较少，结构和功能相对保守，在木质素代谢途径中具有重要的作用。4CL家族主要分为两个亚家族，其中第二亚族主要参与木质素的合成。4CL可以以香豆酸、咖啡酸和阿魏酸等为底物，生成对应的CoA酯化产物。在水稻中抑制Os4CL3的表达会降低植株的木质素含量，导致植物的正常生长受阻[GuiJ,ShenJ,LiL.Functionalcharacterizationofevolutionarilydivergent4-coumarate:coenzymealigasesinrice.PlantPhysiology,2011,157:574-586.]。同样，在柳枝稷中降低或敲除Pv4CL1的表达，植株的木质素含量降低，但生长发育没有受到影响[XuB,Escamilla-TrevinoLL,SathitsuksanohN,ShenZ,ShenH,etal.Silencingof4-coumarate:coenzymeAligaseinswitchgrassleadstoreducedlignincontentandimprovedfermentablesugaryieldsforbiofuelproduction.NewPhytologist,2011,192:611-625.]。另外，高粱的红棕色叶脉突变体bmr2突变体也是由于4CL的突变导致的[SaballosA,SattlerSE,SanchezE,FosterTP,XinZ,etal.Brownmidrib2Bmr2encodesthemajor4-coumarate:coenzymeAligaseinvolvedinligninbiosynthesisinsorghumSorghumbicolorL.Moench.PlantJournal,2012,70:818-830.]。因此，木质素合成关键酶4CL的变化会影响到木质素的含量或组份。Brown-midrib突变体是一类木质素合成相关的突变体，目前已发现天然突变体6个，分别命名为bm1-6。美国先锋-杜邦公司已经利用bm2突变体实现了商业化品种的培育和推广，因此，研究bm突变体的突变机制对低木质素玉米的培育具有重要意义。前期鉴定玉米bm5突变体的突变显著性降低了木质素的含量[TMechinV,LalucA,LegeeF,CezardL,DenoueD,BarriereY,LapierreC.Impactofthebrown-midribbm5mutationonmaizelignins.JAgrFoodChem.2014;62:5102-5107.]，但其突变位点和突变机制并不清楚。本发明主要针对bm5突变位点和突变机制进行分析，通过基因克隆、体外活性检测和体内生理变化等方案确立bm5MaizeGeneticsCOOPStockCenterID：PI262480突变体中Zm4CL1的具体突变机制，并以此为依据，开发分子标记物，为深入理解玉米及其它禾本科植物木质素代谢调控机制提供理论基础，也为定向分子遗传育种提供现实指导意义。发明内容本发明的第一个目的是克隆了玉米bm5突变体的BM5基因，转座子的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。转座子的插入导致4-香豆酰CoA连接酶Zm4CL1活性降低，从而影响木质素的合成。本发明的第二个目的是提供一种鉴定Zm4CL1基因Ac转座子和Mu转座子插入的分子标记；利用该分子标记可以用于鉴定玉米bm5突变体。本发明的第三个目的是提供玉米Zm4CL1基因转座子插入导致4CL活性降低，进而改变木质素组份、提高细胞壁消化率方面的应用。本发明的第四个目的是提供了玉米Zm4CL1基因在定向分子遗传育种改良提高牧草消化率中的应用。所述玉米bm5突变体突变基因Zm4CL1的插入序列，经PCR检测和测序分析，发现其为Ac转座子和Mu转座子，序列长度分别为658bp和283bp；根据转座子序列，我们设计了特异性保守探针，可用于快速鉴定bm5突变体株系；Ac转座子的插入能够导致Zm4CL1转录后蛋白失活，进而丧失功能；Mu转座子的插入导致Zm4CL1转录本显著性降低；4CL活性的降低，能够导致木质素合成受阻，进而改变了bm5突变体的木质素组份，并提高其细胞壁消化率。本发明的核心特点和发明理念包括：1、本发明利用分子生物学手段，通过外显子捕获和PCR扩增克隆获得转座子的BM5基因的插入位点，并以此位点开发分子标记，可用于快速鉴定bm5突变体；2、本发明从调控一碳代谢途径的基因Zm4CL1着手，分析玉米木质素合成途径的调控机制，进一步深入解析了单子叶禾本科植物中木质素对细胞壁消化率的影响。本发明的有益效果如下：1、本发明克隆bm5突变体的突变基因为Zm4CL1，该基因是木质素合成过程中的关键酶基因，这对于研究单子叶植物木质素的合成调控具有重要的理论指导意义；2、本发明中针对Zm4CL1基因外显子插入的Ac转座子和Mu转座子设计的分子标记，对于在玉米突变体育种工作中快速鉴定bm5突变体具有重要的实践意义；3、本发明中所获得的bm5突变体的细胞壁消化率数据资源，对于高消化率玉米育种的应用前景具有重要的实践指导意义。附图说明图1玉米bm5突变体表型图。A、C和E分别为B73植株、叶脉和茎杆表型；B、D和F分别为B73植株、叶脉和茎杆表型。图2玉米bm5突变体BM5基因的克隆。A、bm5-504J的F2代群体的SNP-index值分布图。B、Zm4CL1（GRMZM2G075333）基因在5号染色体上的位置。C、Zm4CL1的基因结构图和bm5插入位点示意图。D、从B73、bm5-504I和bm5-505J基因组中扩增的S1片段以及从B73和bm5-504J基因组中扩增的S2片段。E、从B73、bm5-504I和bm5-504J转录本中扩增的S1片段。F、RT-PCR检测B73和bm5植株中Zm4CL1的表达量。G、qRT-PCR检测B73和bm5植株中Zm4CL1的表达量。图3玉米Zm4CL1基因在B73和bm5突变体中序列比对图。A、Zm4CL1基因在B73、bm5-504I和bm5-505J突变体中序列比对图。B、Zm4CL1基因在B73和bm5-504J突变体中序列比对图。图4玉米bm5-504J中突变后的Zm4CL1的酶活。A、Zm4CL1的两个结构域。结构域用SMART软件分析（http:smart.embl-heidelberg.de）。B、体外表达4CL的蛋白。C、以阿魏酸为底物检测Zm4CL1活性检测液相图。S指可溶性蛋白，I指不可溶性蛋白。D、以阿魏酸为底物检测Zm4CL1-L活性检测液相图。图5Zm4CL1突变对bm5中4CL酶活的影响。材料取自生长60d的玉米，提取了第四片叶叶脉的粗蛋白，分别以香豆酸、咖啡酸和阿魏酸为底物，反应后用LC-MS检测产物。图6玉米bm5突变体的木质素组份分析。图7玉米bm5突变体的中性洗涤纤维的消化率（A）和牧草消化率（B）分析。具体实施方式下面对与bm5表型相关的基因、变异及其分子标记物的具体数据进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂和分子标记探针等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购买。实施例1：玉米bm5突变体表型分析玉米bm5突变体种子来源于maizegdb（www.maizegdb.org）中的突变体库，其StockID分别为504I（bm5-PI251930）、504J（bm5-PI262480）和505J（bm5-PI251893）。使用普通营养土，发种、培育，持续观察表型，待幼苗大约生长至六叶期，叶脉和茎杆均出现红棕色的表型（图1B、D和F）。实施例2：bm5突变体基因克隆和分子鉴定根据外显子捕获分析的结果，我们将突变区域缩小到五号染色体80.8-120.7Mb的区域（图2A）。该区域仅包含两个木质素合成的基因：肉桂醇脱氢酶2CAD2,GRMZM5G844562和4-香豆酸：辅酶A连接酶1Zm4CL1，GRMZM2G075333。鉴于bm1和bm5是独立的bm突变体，因此推测Zm4CL1是BM5基因。随后，我们提取了对照植株（B73）和突变体植株（bm5）的基因组DNA（CTAB法），使用引物Zm4CL1-S1和Zm4CL1-S2，进行常规PCR扩增Zm4CL1基因的部分片段，PCR反应体系为：2μLDNA，5μL10×Buffer，4μLdNTP（2.5mM），正反向引物（10μM）各1μL，0.5μLTaq酶（5UμL）和36.5μLddH2O。在冰上加样后混匀。PCR反应条件为：94oC5min；94oC30sec，56oC30sec；72oC90sec，35个循环；72oC10min。引物序列如下：Zm4CL1-S1-F：AAGGTCTGAGATGGGTTCCGZm4CL1-S1-R：CCTGCCTCCGTCATCCCGTZm4CL1-S2-F：AAGGTCTGAGATGGGTTCCGZm4CL1-S2-R：CACGCCATTATTTATGAGCC电泳结果显示，bm5-504I突变体植株中扩增片段比B73中扩增片段长约300bp（图2D）。随后，我们对两个扩增片段进行凝胶回收（使用Promega凝胶回收试剂盒），常规测序（北京六合华大基因科技有限公司），测序结果显示：bm5-504I突变体中Zm4CL1基因第一个外显子插入一个长290bp的转座子（SEQIDNO.1）。经分析表明，该转座子属于Mu转座子（图3A）。bm5-505J中的突变结果与bm5-504I中一致，因此它们为同一个突变株系。bm5-504J突变体植株中扩增片段比B73中扩增片段长约600bp（图2D）。通过对两个扩增片段进行凝胶回收和常规测序，结果显示：bm5-504J突变体中Zm4CL1基因第一个外显子插入一个长658bp的转座子（SEQIDNO.2）。经分析表明，该转座子属于Ac转座子（图3B）。同时，我们设计引物（Zm4CL1-S2），对野生型植株（B73）和突变体植株（bm5-504I和bm5-504J）的转录本cDNA进行了扩增。电泳显示，bm5-504I突变体中扩增片段与B73比较没有差异（图2E）；测序结果显示，转录本与B73一致。bm5-504J突变体中S2转录本的扩增片段比B73中扩增片段长约200bp（图2E）；测序结果显示bm5-504J突变体中Zm4CL1基因外显子插入片段发生了部分删除，但仍保留了201bp的插入片段。Zm4CL1-S2-F：AAGGTCTGAGATGGGTTCCGZm4CL1-S2-R：CACGCCATTATTTATGAGCC取bm5棕色叶脉新鲜组织，同时取非红色野生型玉米（B73）叶脉组织作为对照，用TriZolReagent（Invitrogen）提取叶脉总RNA，使用琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪（NanoDrop）检测总RNA的含量和纯度，取1.0μg总RNA做逆转录反应，所采用的逆转录酶为M-MLV（Promega），逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录反应合成的第一链cDNA为模板，分别使用引物Zm4CL1-RT和Zm4CL1-3'UTR-qRT作为探针，进行半定量PCR检测和实时荧光定量PCR检测，引物序列如下：Zm4CL1-RT-F：TACGGGATGACGGAGGCAGZm4CL1-RT-R：CGTAATCAGGCTTGTTCTTTGGZm4CL1-3'UTR-qRT-F：TCTTCACCGAATCCATCCCCAZm4CL1-3'UTR-qRT-R：CAGGAATACGTGTCCCTTCTGTTG实时荧光定量PCR反应体系为20μL，其中正反向引物各1μL，cDNA模板2μL，SYBRGreenqRTMasterMix（购自宝生物工程有限公司）10μL，ddH2O补足至20μL。实时荧光定量PCR仪使用Roche480，反应程序使用两步法。经检测，Zm4CL1的表达量在UTR区无显著性变化（图2F和G）。实施例3：Ac转座子对4CL酶活的影响基于实施例1所示的bm5-504J突变体中Zm4CL1表达量没有发生显著性变化和实施例2所示的Zm4CL1基因外显子区插入的Ac转座子，我们分析了Ac转座子插入对Zm4CL1转录后翻译的蛋白活性的影响。使用的方法为体外表达突变后的蛋白，使用的载体为pET32a。首先，我们分别将实施例2中分别获得的B73中Zm4CL1基因突变后的转录本，使用凝胶回收试剂盒（Promega）进行回收，随后使用In-fusion酶（abm公司）连接进入pET32a载体，分别形成Zm4CL1-pET32a，Zm4CL1-L-pET32a，Zm4CL1-S-pET32a重组质粒，转化大肠杆菌EscherichiacoliBL21中。体外通过IPTG（0.2mM）诱导蛋白表达，并检测表达蛋白的酶活。结果显示突变后的蛋白完全丧失活性（图4）。构建载体引物如下：Zm4CL1-32a-F:GATATCGGATCCGAATTCATGGGTTCCGTAGACGZm4CL1-32a-R:GACGGAGCTCGAATTCTCAGTGAACACCGGCGGCGAZm4cl1-l-32a-F:GATATCGGATCCGAATTCATGGGGGTGGGCAAGGZm4cl1-l-32a-R:GACGGAGCTCGAATTCTCAGTGAACACCGGCGGCGAZm4cl1-s-32a-F:GATATCGGATCCGAATTCATGGGTTCCGTAGACGZm4cl1-s-32a-R:CGACGGAGCTCGAATTCTCACGGGCCCACTACCGG同时，我们分别提取了生长60d的B73和bm5-504J玉米第四片叶的叶脉的粗蛋白，分别以香豆酸、咖啡酸和阿魏酸为底物，反应后检测产物的含量。结果显示，突变体中4CL的酶活显著性降低（图5）。4CL活性受抑制影响了木质素反应的进行。为了评估bm5突变体的细胞壁消化率，我们分别检测了中性洗涤纤维消化率和牧草消化率。首先，分别取生长90天的玉米叶脉，40℃干燥96h，研磨粉碎后测定牧草消化率。测定方法为近红外光谱法，使用仪器为PertenDA7200瑞典波通，扫描波长为1100nm-2500nm。每个样品重复8次。结果显示，bm5突变体的中性洗涤纤维消化率NDFD相对性增加22％图7A。随后，我们检测了可发酵糖产量，使用苯酚硫酸酯法[Duboisetal，Colorimetricmethodfordeterminationofsugarsandrelatedsubstances.1956,AnalyticalChemistry,28:350-356]，具体测定方法如下：使用纤维素酶和纤维二糖酶混合物直接酶解细胞壁残留物72h，作为对照；使用1.5％H2SO4在121℃条件下预处理60min，再使用相同量的纤维素酶和纤维素二糖酶混合物酶解细胞壁残留物72h，作为处理组。酶解产物使用苯酚硫酸酯法测定可发酵糖含量。糖化效率是酶解前后可发酵糖含量的差值与酶解前可发酵糖含量的比值。因此，依据公式：可发酵糖产量gplant＝地上部细胞壁碳水化合物产量gplant×糖化效率，计算出转基因植株的可发酵糖产量。测定结果显示，酶解法获得的可发酵糖产量增加了17.6％图7B。实施例5：bm5突变体检测探针的设计和应用考虑到玉米红棕色叶脉突变体的巨大利用价值，但表型鉴定却需要其生长至六叶期之后才能确定，因此本发明利用分子标记物在基因组DNA水平对bm5突变体进行鉴定。根据已开发的SSR标记，我们对BC1[bm5XB73♂Xbm5♀]群体进行了检测，发现bm5与p-umc1591标记相关联。同时结合已鉴定的插入序列，我们进一步开发了验证其为bm5-504I和bm5-504J的探针分别为Zm4CL1-504I和Zm4CL1-504J。该方法可快速鉴定bm5突变体。用于bm5的突变体检测，探针序列如下：p-umc1591-F：CAACCAACTGGCAACTACTCGACp-umc1591-R：GAGGTCTCTCTCGGTCGACATCZm4CL1-504I-F：ACTGTGGGAGTGTCTGGTTGCTGZm4CL1-504I-R：GGAATGGGAACGGAACTGAACGZm4CL1-504J-F：ATCCGACAAGCCAGTCCAZm4CL1-504J-R：GCCGTTACCGTGCCTACCA序列表中国科学院青岛生物能源与过程研究所玉米brownmidrib5（bm5）突变体的突变基因鉴定、变异及其分子标记物2019-01-142SIPOSequenceListing1.01290DNA玉米ZeamaysL.1acgcgttccccaacttttttgcattttagcccttttaggatttcttttgcacaattatgc60cctttgtagtttcatttcaaaaaatggacccttacctcggcgccgtcatcattggcgccg120aggtaacacatagtggcgccaatggtactggcgtcgatgtgtgttacctcggcgccaatg180atgatggcgccgaggttggggtccattttttaaaatgaaactgtaaagggcatagttgtg240caaaaaaaaactcaaaaaaggctaaaattcaaaaaagttggcacgcgttc2902658DNA玉米ZeamaysL.2cctgtccctagagatgtccaaacgggccggcccggtagtgggcccgtgacccggcacggt60cgtggcccggcacgagcacggcacggcccgactagaggcgtgcccgggccggcccggttc120aatagccgtgccgggcttgggctagccgtcgggcccgcggtgcaggcacgggcccgacac180ggttaattggtaggcacggtaacggcccgtttgagggactgattttataacggtcagtct240atttttagctataatacttatgatatgttattatatgagagcattctgacttgtaatatg300tgtttatatgtgtatctaaaattcttttgtctaaatatgtatctaaaattataaatataa360ttaattaaatctaaaataaatttgaatataacatttaaattctgaattttgaagtgtttt420ttttgtttatgggaccgggcccgacccgacacgacaggcccgccgtgcctccggcccggc480acggcccgtgtaagaataaccgtgccgggcttgggccgcgttagccggcccacgggccgg540cccggcacggcacgataccaaaccgtgccgggcttggactagtgcctctcgtgccgggcc600aagccgtgcccgggccgggccggcccggcacggcccattggacatgtatacctgtccc658

权利要求：1.通过对玉米bm5突变基因BM5的克隆，分离的玉米4-香豆酰CoA连接酶基因Zm4CL1，其分别包含序列加长的突变体Zm4CL1的外显子区序列和内含子序列，其特征分别为：插入的Ac转座子的SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；插入的Mu转座子的SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。2.一种用于鉴定权利要求1中所述的Ac转座子和Mu转座子的分子标记物。3.根据权利要求3所述的方法，其中通过与包含权利要求1所述的转座子插入的Zm4CL1基因的玉蜀黍植物杂交，将权利要求1的核酸分子导入所述玉蜀黍属植物中。4.根据权利要求2所述的方法，其中包括基于权利要求1中所述的核酸分子中设计开发的包含Ac转座子和Mu转座子序列的分子标记物。5.权利要求1所述的一种分离的玉米4-香豆酰CoA连接酶基因Zm4CL1在玉米及其他单子叶禾本科植物木质素改良中的应用。

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