买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：中国海洋大学

摘要：本发明公开了一种表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌，其基因组中包含有编码黑芥子酶TGG4的基因。编码黑芥子酶TGG4的基因如SEQIDNO.1所示；黑芥子酶TGG4如SEQIDNO.2所示。该重组解脂耶氏酵母菌在制备黑芥子酶TGG4中的应用，在制备莱菔素中的应用，在降解莱菔苷中的应用。本发明还公开了一种酶制剂，通过培养该重组解脂耶氏酵母菌并收集菌体制得。本发明的食品级解脂耶氏酵母菌，能够高效表达黑芥子酶TGG4，可以在体外催化萝卜种子中的莱菔苷水解产生莱菔素。黑芥子酶TGG4是附着或镶嵌在细胞表面的，可以通过回收细胞实现黑芥子酶的重复利用，进行高效率、多批次的重复制备。

主权项：1.一种降解莱菔苷或制备莱菔素的方法，其特征在于：采用含黑芥子酶TGG4的酶制剂降解莱菔苷，制得莱菔素；所述降解条件为：温度25℃，pH为5.0，反应时间1.5小时；所述含黑芥子酶TGG4的酶制剂是通过以下方法制备得到：挑取重组菌株，接种在10mlYPD液体培养基中，30℃，200rpm培养16h后按1%的接种量接入250mlPPB培养基，30℃，200rpm发酵5d；将发酵液离心收集菌体，冻干，即得含黑芥子酶TGG4的酶制剂；所述重组菌株为表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌，其基因组中包含有编码黑芥子酶TGG4的基因；所述编码黑芥子酶TGG4的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述黑芥子酶TGG4的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述重组菌株是通过以下方法构建得到的：以合成的SEQIDNO.1所示的基因片段为模板，在黑芥子酶基因的上、下游设计用于无缝连接的引物，进行PCR扩增TGG4基因片段；所述引物的序列如下所示：上游引物：5’-CGGCCGTTCTGGCCTCCCAGAAGGTTTGTAACCCAG-3’，如SEQIDNO.3所示；下游引物：5’-CTCTAAGTTCCTTGCGAAGatgagcaaag-3’，如SEQIDNO.4所示；在TGG4基因后面连接绿色荧光蛋白GFP，在其上、下游设计用于无缝连接的引物，进行PCR扩增GFP基因片段；所述引物的序列如下所示：上游引物：5’-TGCGAAGatgagcaaaggcgaag-3’，如SEQIDNO.5所示；下游引物：5’-gatgatgatgcttatacagttcatcca-3’，如SEQIDNO.6所示；PCR反应体系为：2×PCRBuffer25μl，dNTP10μl，引物各1.5μl，模板1μl，KODFx酶1μl，无菌水10μl，总体系50μl；PCR反应条件为：94℃预变性5min，95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸分别为120s和60s，反应30个循环，72℃后延伸10min；琼脂糖凝胶电泳后分别回收1467bp和714bp的PCR产物片段；上述PCR扩增得到的基因片段与pINA1314克隆载体采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入E.coliDH5α感受态细胞，涂布于含有50μgml卡那霉素的LB培养基固体平板上，37℃温箱中培养12～16h后，挑取单克隆至含有50μgml卡那霉素LB液体培养基，转速220rpm的37℃摇床培养过夜，阳性验证后测序，并命名为pINA1314-TGG4-GFP；提取测序正确的重组质粒，设计引物将质粒线性化，并转化至宿主Y.lipolyticaPO1g感受态细胞中，构建好的工程菌在尿嘧啶缺陷型的平板上长出；所述引物的序列如下所示：上游引物：5’-TCTACTGAACGGTGATCCCCACCGGA-3’，如SEQIDNO.7所示；下游引物：5’-ATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCAC-3’，如SEQIDNO.8所示；PCR反应体系为：2×PCRBuffer25μl，dNTP10μl，引物各1.5μl，模板1μl，KODFx酶1μl，无菌水10μl，总体系50μl；PCR反应条件为：94℃预变性5min，95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸300s，反应30个循环，72℃后延伸10min。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国海洋大学 表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌及其应用