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申请/专利权人：山西医科大学

摘要：本发明属生物技术领域，提供一种全身性Plin1基因敲除动物模型构建及其鉴定方法。构建方法步骤为：针对Plin1基因2号外显子前后序列设计sgRNA序列，构建Plin1基因敲除载体并进行体外转录获得sgRNA；将sgRNA与Cas9蛋白混合后显微注射入小鼠受精卵中，获得全身性Plin1基因敲除小鼠。本项目的有益效果在于筛选出了一对评分最高的sgRNA序列，保证了项目的成功率；实现了Plin1基因2号外显子的大片段敲除，提高了敲除效率；针对敲除区域设计3条引物，成功鉴定出了小鼠的各类基因型，避免了大片段敲除时2条引物可能无法区分基因型的情况。为研究PLIN1的生物学功能及肥胖相关代谢性疾病的发病机制提供便捷、可靠、经济的动物模型和良好的基础。

主权项：1.一种全身性Plin1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于：所述方法基于CRISPRCas9基因敲除技术，包括以下步骤：（1）针对Plin1基因2号外显子前后序列设计1对sgRNA序列，通过构建Plin1基因敲除载体及体外转录获得sgRNA；（2）将sgRNA与Cas9蛋白混合组成的Cas9sgRNA体系的小鼠受精卵显微注射，F0代小鼠出生及鉴定，F0代小鼠性成熟配繁，F1代小鼠鉴定，F1代阳性小鼠雌雄近交获得F2代小鼠，即为全身性Plin1基因敲除小鼠；所述sgRNA核苷酸序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示；所述sgRNA的筛选及获得方法为：（1）针对小鼠Plin1基因2号外显子序列，在NCBI中查询小鼠Plin1基因的基本信息，应用在线工具http:crispr.mit.edu设计识别Plin1基因2号外显子前后的sgRNA序列对；（2）根据脱靶位点、基因数和发生错配的可能性大小进行评估筛选，选择1对sgRNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:1，SEQIDNO:2所示；（3）选择CRISPR基因敲除质粒pX330作为载体，用限制性内切酶BBS切割pX330质粒BBS酶切位点即第245、267位置，使其线性化；（4）向2条Plin1sgRNA的5’端添加粘性末端后与线性化载体用T4DNA连接酶进行连接，在pX330gRNAscafflod位置加入sgRNA序列构建Plin1基因CRISPRCas9敲除载体Plin1-1，Plin1-2；构建好的质粒载体转化至DH5α菌群中，2d后挑取单克隆菌落测序及限制性核酸内切酶ApaLI+NcoI双酶切法鉴定，载体序列信息如SEQIDNO:3,4所示；（5）按照sgRNA体外转录试剂盒即PC1380说明书设计正向引物SG1-F、SG2-F和通用下游引物SG-R，序列如SEQIDNO：5，SEQIDNO：6，SEQIDNO：7所示，PCR扩增转录模板后进行sgRNA转录，转录完全并纯化后进行琼脂糖凝胶电泳实验检测sgRNA片段大小及完整性。

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百度查询： 山西医科大学 一种全身性Plin1基因敲除动物模型构建及鉴定方法