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申请/专利权人：佛山科学技术学院

摘要：本发明提供了一种产烟酸的超级重组耻垢分枝杆菌的构建方法，包括步骤：1）构建质粒pMHS‑NrtRms；2）构建质粒pHAGE‑NrtRms；3）制备重组TM4噬菌体；4）构建nrtRms基因缺失的耻垢分枝杆菌mc2100；5）nudC基因的扩增及构建质粒pMV361‑NudCms；6）构建nrtRms基因敲除且nudC基因过表达的超级重组耻垢分枝杆菌。本发明通过构建nrtR基因敲除且nudC基因过表达制得超级重组耻垢分枝杆菌，通过本发明制备得到的工程菌可以一步直接获得烟酸，而不依赖于添加3‑氰基吡啶，不仅避免了现有在烟酸化学合成过程中的各种缺点，而且生产条件简单，无污染，简便易行，易放大，成本低，适合于大规模工业化生产应用，有很大的推广应用的价值。

主权项：1.一种产烟酸的超级重组耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1）构建质粒pMHS-NrtRms：1-1）以耻垢分枝杆菌mc2155基因组DNA为模板、SEQIDNo.1~4所示的引物对进行PCR扩增，电泳分离后经Van91I限制性内切酶酶切备用；1-2）将含有pMHS质粒的大肠杆菌DH5α菌株扩大培养，然后收集菌体，抽提质粒，质粒经Van91I限制性内切酶酶切后电泳分离，回收1600bp区间和3600bp区间的DNA片段；1-3）将步骤1-1与1-2所获得的DNA片段经T4DNA连接酶16ºC反应过夜，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞扩大培养，抽提质粒后获得质粒pMHS-NrtRms；2）构建质粒pHAGE-NrtRms：2-1）分别扩大培养含有质粒pHAGE和质粒pMHS-NrtRms的大肠杆菌DH5α菌株，抽提质粒，两个质粒经PacI限制性内切酶线性化后再用T4DNA连接酶16ºC反应过夜，连接产物使用包装试剂盒包装并转化至大肠杆菌HB101感受态细胞扩大培养，抽提质粒后获得质粒pHAGE-NrtRms；3）制备重组TM4噬菌体：3-1）扩大培养耻垢分枝杆菌mc2155，振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，用预冷的10%无菌甘油洗涤菌体，然后加入预冷的10%的甘油重悬菌体，-80ºC冻存备用；3-2）将质粒pHAGE-NrtRms转入耻垢分枝杆菌mc2155电转感受态细胞中，冰上孵育10min，然后电击转化，转化后加入7H9液体培养基，37ºC培养箱孵育过夜，将37ºC放置后的菌液加到含有topagar的EP管中混匀并倾倒平铺在7H10固体平板上，平板置30ºC培养箱培养2-3天，获得重组TM4噬菌体；4）构建nrtRms基因缺失的耻垢分枝杆菌mc2100：7H9液体培养基培养耻垢分枝杆菌mc2155至对数生长期，离心收集菌体，用MPbuffer洗涤离心获得菌体，然后用MPbuffer重悬菌体，将重悬的耻垢分枝杆菌mc2155与滴度为1010PFU的重组TM4噬菌体以1:1体积混合后培养箱孵育，然后离心收集菌体弃上清后用7H9液体培养基重悬，放置培养箱孵育过夜，再次离心收集菌体弃上清，菌体涂布7H10固体平板培养，获得分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌mc2100；5）nudC基因的扩增及构建质粒pMV361-NudCms：5-1）nudc基因的扩增：以耻垢分枝杆菌mc2155基因组DNA为模板，使用SEQIDNo.9~10所示的引物对PCR扩增nudC基因ORF序列，PCR产物经电泳分离回收后使用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切，回收酶切后的DNA备用；5-2）酶切：LB培养含pMV361质粒的大肠杆菌DH5α菌株，抽提质粒后使用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切，然后进行电泳分离，回收线性化的质粒；5-3）连接：酶切回收的DNA片段和经同样酶切回收的线性化质粒pMV361经T4DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂布LB固体平板，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜，获得质粒pMV361-NudCms，所述LB固体平板含100μgmL硫酸卡那霉素；6）构建nrtRms基因敲除且nudC基因过表达的超级重组耻垢分枝杆菌：6-1）制备突变耻垢分枝杆菌mc2100感受态细胞：7H9液体培养基培养步骤4获得的突变耻垢分枝杆菌mc2100至对数生长期，离心收集菌体，将菌体用预冷的10%无菌甘油至少洗涤两次，最后加入适量预冷的10%的甘油，吹匀菌体后，分装置-80℃冻存备用；6-2）转化突变耻垢分枝杆菌mc2100：将质粒pMV361-NudCms转入突变耻垢分枝杆菌mc2100电转感受态细胞中，冰上孵育10min，然后电击转化，然后加入7H9液体培养基，37℃培养箱孵育过夜，然后取适量培养液涂布7H10固体平板，平板置37℃培养箱培养3～5天，获得产烟酸的超级重组耻垢分枝杆菌，所述7H10固体平板含50μgmL硫酸卡那霉素。

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