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申请/专利权人：大连医科大学

摘要：本发明公开了一种重组ΔAmi1蛋白的耻垢分枝杆菌及其构建方法，包括步骤：S1、构建Rv3717‑NTD大肠杆菌表达质粒；S2、构建Rv3717‑NTD分枝杆菌表达质粒；S3、基于Rv3717‑NTD重组分枝杆菌表达质粒构建了重组ΔAmi1蛋白的耻垢分枝杆菌。实验结果表明，本发明构建的Rv3717‑NTD分枝杆菌表达质粒可以在分枝杆菌系统内高表达6*His‑sumo融合ΔAmi1蛋白，构建的重组ΔAmi1蛋白的耻垢分枝杆菌不仅具有促进TLR2表达和IgG2a分泌的作用，能激活宿主LC3相关天然免疫效应，而且具有增强宿主细胞清除胞内病原体的作用，因此具有良好免疫原性和天然免疫激活效应。

主权项：1.一种重组ΔAmi1蛋白的耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、构建Rv3717-NTD大肠杆菌表达质粒：根据结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组数据库中Rv3717基因的核苷酸序列设计PCR引物，具体为Rv3717-NTD，利用Rv3717基因的上游引物F1和下游引物R1扩增开放阅读框中58-543bp的核苷酸序列，在上游引物和下游引物分别引入BamHI和HindⅢ酶切位点，并加入保护性碱基，其中，引物序列具体如下：上游引物F1：5'CGGGATCCACCCCCGCCATC3'下游引物R1：5'CCCAAGCTTCTACAGGCCGTCCTGGC3'将阳性重组质粒进行DNA序列测定，将测序结果与结核分枝杆菌H37Rv基因组数据库中的Rv3717序列进行分析比对，以保证重组质粒中基因序列的正确性；将BamHI和HindⅢ双酶切后的目的基因与pCold-SUMO载体连接、转化，构建相应的Rv3717-NTD重组大肠杆菌表达质粒，命名为pCold-SUMO-Rv3717-NTD重组质粒；S2、构建Rv3717-NTD重组分枝杆菌表达质粒：首先，通过NdeI和HindIII双酶切去除pSUMKan-MCS2-GFP质粒中GFP基因片段，获得pSUM-Kan-MCS2NdeI+HindIII表达载体；接着，以步骤S1构建的pCold-SUMO-Rv3717-NTD重组质粒为模板，进行PCR扩增，获得带有6*His-SUMO标签的目的基因；然后，在上游引物F2的5’端引入NdeI酶切位点和下游引物R2的3’端引入HindⅢ双酶切位点，其中，上游引物F2和下游引物R2的序列具体如下：上游引物F2：5'GGCATATGAATTGGAGCCACCCGCAG3'下游引物R2：5'CCCAAGCTTCTACAGGCCGTCCTGGC3'将SEQIDNo.1所示的6*His-sumo-Rv3717-NTD基因片段进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收和纯化PCR扩增产物，目的基因与pMD18T载体连接，并进行连接产物的转化；阳性重组质粒的目的基因序列进行比对后，进一步进行NdeI和HindⅢ双酶切后，回收目的片段；最后，将所得酶切回收的目的基因片段与酶切回收的pSUM-Kan-MCS2载体片段进行连接，转化，得到SEQIDNo.2所示的Rv3717-NTD重组分枝杆菌表达质粒，命名为pSUM36-His-sumo-Rv3717-NTD重组质粒；S3、基于Rv3717-NTD重组分枝杆菌表达质粒，利用电转化方式构建得到重组ΔAmi1蛋白的耻垢分枝杆菌，命名为rM.smegRv3717-NTD重组菌株。

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