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摘要：本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的Cre‑LoxP重组系统及其应用。本发明提供了一种辣椒轻斑驳病毒PMMoV‑GFP侵染性克隆的Cre‑LoxP重组系统，其包括pJM23载体、pJG102载体和pCre载体。进一步通过采用将Cre基因与pJG102载体融合的方式，简化Cre‑LoxP重组系统载体数量，构建了由pJM23载体和pJG2303载体所组成的PMMoV‑GFP侵染性克隆的Cre‑LoxP重组系统。通过本发明所述的Cre‑LoxP重组系统降低了对PMMoV全序列改造的难度，提高了PMMoV外源蛋白表达系统的可操作性。

主权项：1.一种辣椒轻斑驳病毒PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统，其特征在于，所述Cre-LoxP重组系统包括pJM23载体、pJG102载体和pCre载体；所述pJM23载体的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示；所述pJG102载体的核苷酸序列如SEQIDNo.15所示；所述pCre载体由Cre序列融入双元表达载体构建得到。

全文数据：辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统及其应用技术领域本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统及其应用。更具体地，涉及利用Cre-LoxP重组系统实现携带外源GFP基因的辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆载体的重组。背景技术辣椒轻斑驳病毒peppermildmottlevirus,PMMoV属于烟草花叶病毒属Tobamovirus成员，病毒粒体呈直杆状，为正单链RNA病毒，基因组由6357个核苷酸组成，共有4个开放阅读框架openreadingframes,ORFs，编码4个蛋白，分别编码病毒复制酶蛋白p12670-3421nt、病毒复制酶蛋白p18370-4906nt、运动蛋白MPmovementprotein,4909-5680nt和外壳蛋白CPcoatprotein,5685-6156nt。PMMoV是危害辣椒生产的重要病毒之一，植株被侵染后表现出斑驳或黄绿相间的花叶症状，果实被侵染后出现畸形、斑驳，引起辣椒落叶、落花、落果，在全世界范围内严重威胁着辣椒的生产。Cre重组酶是大肠杆菌P1噬菌体cre基因的38.5kDa产物，其能识别并催化LoxP位点间的重组。LoxP是一段长度为34bp的DNA序列，包括被8bp间隔的2个13bp的反向重复序列，每个反向重复及其临近的4bp构成一个Cre蛋白结合区，其序列如下：ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT。间隔的非对称性决定了LoxP位点具有方向性。Cre重组酶不需要其他一些辅助因子即能特异性识别LoxP位点，完成活体内和体外细胞中的DNA重组。Cre介导的重组过程是一个动态、可逆的过程，根据LoxP位点位置可以分成三种情况：1如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；2如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；3如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。通过在目的基因序列中引入LoxP序列，利用Cre酶诱导LoxP位点进行特异性整合或重组，以期实现更简单、更有效地对目的基因组进行遗传修饰和改造，促进对基因功能的研究。发明内容本发明将携带外源GFP基因的辣椒轻斑驳病毒Peppermildmottlevirus，PMMoV侵染性克隆载体拆分为约4kb和2kb载体，在相应目的片段引入LoxP序列，利用Cre酶诱导LoxP位点在植物体内重组形成完整的PMMoV-GFP病毒序列，从而产生具有侵染活性的PMMoV-GFP病毒粒子。本发明的目的之一是提供一种辣椒轻斑驳病毒PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统。在一些优选方式中，所述Cre-LoxP重组系统包括pJM23载体、pJG102载体和pCre载体。在一些优选方式中，所述pJM23载体由PMMoV-GFP侵染性克隆序列的RdRpp126p183以及MP部分序列融入pCB301构建得到，其3’末端引入内含子前半部分序列5’-gtaggtttcattttcataattacacaaatttagatttgatttttgtt-3’及LoxP序列5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’，所述pJM23载体的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示。在一些优选方式中，所述pJM102载体由PMMoV-GFP侵染性克隆序列的MP另一部分序列、GFP、CP融入pCB301构建得到，其5’末端引入内含子后半部分序列5’-ttttattacatgtttgaacttcaacaatttatgactttttgttcttattgttgcag-3’及LoxP序列5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’，所述pJM102载体的核苷酸序列如SEQIDNo.15所示。在一些优选方式中，所述pCre载体由Cre序列融入双元表达载体构建得到。在一些优选方式中，所述PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统的构建方法包括以下步骤：1获得PMMoV-GFP侵染性克隆的核苷酸全序列；2设计引物pJM23-1fr,pJM23-2fr,pCB301-fullfr，扩增引入LoxP序列的目的片段，利用Vazyme的ClonExpressMultiSOneStepCloningKit将PCR扩增获得的pJM23-1、pJM23-2、pCB301-full片段直接重组构建成pJM23载体；3设计引物pJG102fr，pCB301-102fr，扩增引入LoxP序列的目的片段，利用Vazyme的ClonExpressIIOneStepCloningKit将PCR扩增获得的pJG102、pCB301-102将pCB301缺失35S启动子片段直接重组构建成pJG102载体；4设计引物pCrefr扩增Cre基因片段，利用XbaI和SacI双酶切连入双元表达载体后构建得到pCre载体；5将上述三种载体采用农杆菌介导法共转化本氏烟，体内Cre基因表达后获得重组的PMMoV-GFP侵染性克隆。作为优选，所述的引物的碱基序列如SEQIDNo.2～SEQIDNo.13所示。本发明的另一个目的是提供另外一种辣椒轻斑驳病毒PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统。在一些优选方式中，所述Cre-LoxP重组系统包括pJM23载体和pGJ2303载体。在一些优选方式中，所述pJM23载体由PMMoV-GFP侵染性克隆序列的RdRpp126p183以及MP部分序列融入pCB301构建得到，其3’末端引入内含子前半部分序列5’-gtaggtttcattttcataattacacaaatttagatttgatttttgtt-3’及LoxP序列5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’，所述pJM23载体的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示；所述pJG2303载体由pJG102载体和35S-Cre-RZ-NOS融合而成，其核苷酸序列如SEQIDNo.16所示。在一些优选方式中，所述的PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统的构建方法包括以下步骤：1获得PMMoV-GFP侵染性克隆的核苷酸全序列；2设计引物pJM23-1fr,pJM23-2fr,pCB301-fullfr，扩增引入LoxP序列的目的片段，利用Vazyme的ClonExpressMultiSOneStepCloningKit将PCR扩增获得的pJM23-1、pJM23-2、pCB301-full片段直接重组构建成pJM23载体；3设计引物pJG2303fr，pCB301-full-RHfr，扩增将35S-Cre-RZ-NOS序列利用Vazyme的ClonExpressIIOneStepCloningKit引入pJG102载体，重组构建得到pJG2303载体；4将上述两种载体采用农杆菌介导法共转化本氏烟，体内Cre基因表达后获得重组的PMMoV-GFP侵染性克隆。作为优选，所述的pJG2303载体构建的引物的碱基序列如SEQIDNo.17～SEQIDNo.20所示。本发明的第三个目的是提供一种辣椒轻斑驳病毒PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统的应用。在一些优选方式中，通过将pJG102载体中PMMoV的CP基因替换为烟草花叶病毒TMV的CP基因，农杆菌介导法共转化本氏烟后产生了具有生物活性的PMMoV-GFP侵染性克隆。本发明通过将PMMoV侵染性克隆拆分为约为4kb和2kb的两个载体，在相应目的片段引入LoxP序列，利用Cre酶诱导LoxP位点在植物体内重组后形成完整的PMMoV-GFP病毒序列，从而产生具有侵染活性的PMMoV-GFP病毒粒子。通过本发明所述的Cre-LoxP重组系统，可仅通过改造2kb载体，即改造pJG102载体就能实现对PMMoV-GFP侵染性克隆的CP基因及外源蛋白序列的改造，简化了PMMoV序列的改造过程，降低了对PMMoV全序列改造的难度，提高了PMMoV外源蛋白表达系统的可操作性。本发明提供了一种可以简单、有效地对目的基因组进行遗传修饰和改造的方法，通过本发明所提供的重组系统不仅能够有效的缩短病毒基因改造的时间，大量节省相关试剂耗材和改造成本，并且可以利用该系统进行相关基因的功能研究，促进相关基因功能的开发。附图说明图1是PMMoVCre-LoxP重组系统原理。图2是pJM23载体图谱。图3是pJG102载体图谱。图4是pCre载体图谱图5是pJM23+pJG102+pCre共浸润PMMoV系统侵染及电镜检测结果。图6是载体pJG2303构建示例及图谱，其中，图A为pJG2303载体构建策略示意图，图B为pJG2303载体图谱。图7是pJG2303+pJM23共浸润后PMMoV发生系统侵染。图8是pJG102的CP基因序列替换为TMV的CP基因序列后发生系统侵染。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1：PMMoV-GFP侵染性克隆PMMoV-GFP侵染性克隆为原始的PMMoV病毒基因序列中插入GFP基因所形成，即在辣椒轻斑驳病毒编码的运动蛋白与外壳蛋白之间插入烟草轻绿花叶病毒Tobaccomildgreenmosaicvirus,TMGMV的外壳蛋白基因启动子及外源GFP基因，具体构建过程参见发明专利申请CN2015104808267。所述的可表达外源GFP蛋白的PMMoV-GFP侵染性克隆载体的全序列如SEQIDNo.1所示。实施例2：由三个载体所组成的PMMoV-GFP侵染性克隆Cre-LoxP重组系统的构建1、载体构建PMMoV-GFP侵染性克隆序列包含5个开放阅读框ORF，依次为RdRpp126、RdRpp183、MP、GFP、CP。根据PMMoV-GFP侵染性克隆序列的开放阅读框，将其全序列进行拆分，通过将相应拆分片段融合到带35S启动子和核酶Rz的植物表达载体pCB301商业购买制备得到相应的拆分载体，并在相应片段引入LoxP序列，从而形成Cre-LoxP重组系统，通过Cre载体诱导基因重组。将PMMoV-GFP侵染性克隆序列的RdRpp126p183以及MP部分序列融入pCB301构建得到第一载体，命名为pJM23，其含35S启动子及NOS终止子；将MP另一部分序列、GFP、CP融入pCB301将其缺失35S启动子构建得到第二载体，命名为pJG102，其缺失35S启动子，仅含有NOS终止子；将Cre序列融入双元表达载体pCV1300构建得到第三载体，命名为pCre。上述pCV1300载体为将质粒pCAMBIA1300和PBI121质粒利用HindIII和EcoRI双酶切，将pBI121的35S-GUS-NOS区段连入pCAMBIA1300载体构成而成。分别根据相应序列设计引物，通过PCR扩增技术得到相应片段，引物序列见表1所示。表1引物序列表载体pJM23通过引物pJM23-1fr，pJM23-2fr，pCB301-fullfr扩增出三个片段，pJM23-12片段为PMMoV片段，在pJM23-2片段3’末端引入内含子前半部分序列5’-gtaggtttcattttcataattacacaaatttagatttgatttttgtt-3’及LoxP序列5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’，pCB301-full为载体片段。载体pJG102通过引物pJG102fr，pCB301-102fr扩增出两个片段，pJG102片段5’末端引入内含子后半部分序列5’-ttttattacatgtttgaacttcaacaatttatgactttttgttcttattgttgcag-3’及LoxP序列5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’，pCB301-102为缺失35S的载体序列。以pCRE质粒携带有Cre基因的克隆载体为模板，以pCrefr为引物扩增Cre片段。1pJM23和pJG102的构建PCR扩增体系为：9μLDEPC水、25μL2×PCRBufferforKODFXNeo、10μL2mMdNTPs、上下游引物10μM各1.5μL、2μLcDNA模板、1μLKODFXNeo聚合酶，总反应体系为50μL；各片段的反应条件为：94℃2min，94℃15s，60℃30s，68℃3.5min，35个循环；68℃10min。采用Vazyme公司的ClonExpressMultiSOneStepCloningKit重组克隆试剂盒将纯化的扩增目的片段与相应载体重组完成上述两个载体的构建。采用10μL体系反应，其中5×CEMultiSBuffer2μL，pCB301-full片段120ng，pJM23-1、pJM23-2片段各60ng，ExnaseTMMultiS1μl，最后用ddH2O调整体系至10μL。使用移液器上下吹打数次，轻轻混匀各组分。置于37℃反应30min。反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min载体构建图谱见图2所示。采用Vazyme公司的ClonExpressIIOneStepCloningKit重组克隆试剂盒将纯化的扩增目的片段与相应载体重组完成上述两个载体的构建。采用10μL体系反应，其中5×CEIIBuffer2μL，pCB301-102片段120ng，pJG102片段60ng，ExnaseTMII1μl，最后用ddH2O调整体系至10μL。使用移液器上下吹打数次，轻轻混匀各组分。置于37℃反应30min。反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min载体构建图谱见图3所示。2pCre的构建PCR反应体系为：10×PrimeSTARbuffer6μL，dNTPs6μL，上下游检测引物各0.5μL，模板DNA0.5μL，PrimeSTARDNA聚合酶0.5μL，水46.5XXμL。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，68℃延伸15sec，40个循环后，72℃继续延伸15sec。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳得到目的基因片段，回收纯化目的片段，并对回收片段进行测序。PCR扩增产物采用凝胶电泳分离回收后，与-TEasyVector连接，构建得到T-Cre；XbaI、SacI双酶切T-Cre和pCV1300。酶切反应体系为：质粒30μL，相对应的内切酶酶切缓冲液6μL，限制性内切酶各2μL，水20μL。将载体质粒或者PCR产物在所用限制性内切酶的最适温度下进行酶切约12小时。将酶切反应完成后得到的产物在1％vw琼脂糖凝胶中分离并回收所需要的片段以备连接用。连接反应总体积20μL，目的基因与载体比为15：2，T4DNA连接酶1U，16℃连接12～16h；其载体图谱如图4所示。2、转化农杆菌及菌种保存取-70℃保存的C58C1农杆菌感受态，置冰上融解。取1μL抽纯pJM23、pJG102、pCre质粒分别加入到100μL感受态中，混匀，加入到处理好的电击杯。设置2.2V电压，电击转化。点击完成加入900μL的液体培养基YEP。28℃，200rpm摇床培养2h，菌液涂布在含50μgμL卡那霉素Kan和100μgμL利福平Rif平板上，28℃培养至形成单菌落。挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μgμLKan、100μgμLRif的液体培养基中，28℃，200rpm摇培16h，取1μL菌液进行PCR检测。经测序得到pJM23载体的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示，pJG102载体的核苷酸序列如SEQIDNo.15所示。取检测结果为阳性的菌液，混合15-30％甘油，置甘油管中，于-70℃超低温冰箱中保存。3、PMMoV-GFP侵染性克隆Cre-LoxP重组系统体内重组分别挑取pJM23、pJG102、pCre单斑接种于含有Kan50mgL和Rif50mgL抗性的YEP培养基中28℃过夜振荡培养；然后比例转接到相同抗性的LB培养基中，生长至对数生长期A600值约为0.6-0.8，经8000rpmmin离心5min收集菌体；用含终浓度为10mMMgCl2，10mMMESpH5.6，200uM乙酰丁香酮Ace的无菌水重悬浮，调整菌液浓度至OD600为1.0。将三种载体按pJM23：pJG102：pCre＝1:0.5:0.5的比例混合后在室温下放置3小时以上。用1μL注射器无针头吸取上述混合农杆菌菌液待用。选取4～6片真叶的本氏烟，在叶片背面将菌液渗透注射到叶片组织间隙中。每个处理注射6～8株，将浸润好的植株在暗处放置3～6小时后移到25℃温室中培养16小时光照8小时黑暗交替。接种后第6天，紫外灯下观察发现系统叶出现明显绿色荧光如图5所示，说明外源蛋白GFP在植物体内得到了稳定高表达。4、系统叶重组病毒粒子鉴定将系统叶进行负染电镜检测，从图5可以看出，顶部叶片中存在300nm左右的杆状病毒粒子。利用Trizol提取总RNA，反转录后PCR扩增PMMoV的MP序列，将目的条带切胶回收后T4连接pGEM-T载体，4℃过夜后转化T1大肠杆菌感受态，37℃培养过夜后，菌落PCR鉴定单菌落，挑取阳性克隆进行测序。测序结果表明MP序列中的Intron剪切完全，顶部叶片的绿色荧光确实由Cre-LoxP重组后的PMMoV病毒粒子产生图5。以上结果表明构建的PMMoV-GFP侵染性克隆经Cre-LoxP重组后具有生物学活性，能成功侵染本氏烟，并可以成功表达外源蛋白。实施例3：由两个载体所组成的PMMoV-GFP侵染性克隆Cre-LoxP重组系统的构建本实施例通过对PMMoV-GFP侵染性克隆的全序列和Cre序列进行拆分和合并，简化其Cre-LoxP重组系统载体数量，通过两个载体构建PMMoV-GFP侵染性克隆Cre-LoxP重组系统，具体步骤如下：1、将PMMoV-GFP侵染性克隆序列的RdRpp126p183以及MP部分序列融入pCB301构建得到第一载体，命名为pJM23，其含35S启动子及NOS终止子，其3’末端引入内含子前半部分序列5’-gtaggtttcattttcataattacacaaatttagatttgatttttgtt-3’及LoxP序列5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’，所述pJM23载体的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示；将35S-Cre-RZ-NOS融入pJG102载体构建得到第二载体，命名为pJG2303，所述pJG2303载体的核苷酸序列如SEQIDNo.16所示，其构建策略和载体图谱如图6所示；2、pJM23载体和pJG2303载体的构建过程同实施例2所述，其中，所述pJG2303载体构建的引物的碱基序列如SEQIDNo.17～SEQIDNo.20所示；3.PMMoV-GFP侵染性克隆Cre-LoxP重组系统体内重组分别挑取pJM23、pJG2303单斑接种于含有Kan50mgL和Rif50mgL抗性的YEP培养基中28℃过夜振荡培养；然后比例转接到相同抗性的LB培养基中，生长至对数生长期A600值约为0.6-0.8，经8000rpmmin离心5min收集菌体；用含终浓度为10mMMgCl2，10mMMESpH5.6，200uM乙酰丁香酮Ace的无菌水重悬浮，调整菌液浓度至OD600为1.0。将两种载体按pJM23：pJG2303＝1:1的比例混合后在室温下放置3小时以上。用1μL注射器无针头吸取农杆菌菌液待用。选取4～6片真叶的本氏烟，在叶片背面将菌液渗透注射到叶片组织间隙中。每个处理注射6～8株，将浸润好的植株在暗处放置3～6小时后移到25℃温室中培养16小时光照8小时黑暗交替。接种后第8天，紫外灯下观察发现系统叶出现明显绿色荧光，负染电镜观察发现杆状病毒粒子图7，表明构建的PMMoV-GFP侵染性克隆经Cre-LoxP重组后具有生物学活性，能成功侵染本氏烟，并可以成功表达外源蛋白。通过本方法所构建的PMMoV-GFP侵染性克隆Cre-LoxP重组系统同样能够重组产生PMMoV-GFP侵染性病毒粒子。实施例4：PMMoV-GFP侵染性克隆Cre-LoxP重组系统的应用本实施例以将pJG102载体中PMMoV的CP基因替换为烟草花叶病毒Tobaccomosaicvirus，TMV的CP基因为例，对PMMoV-GFP侵染性克隆Cre-LoxP重组系统的应用进行说明。利用高保真酶商业购买，以pJG102-Repfr和Rep-TMVfr为引物分别扩增pJG102-Rep载体片段和需替换的TMV的CP片段，引物的碱基序列如表2所示，PCR扩增反应体系及程序同实施例2所述。将回收的PCR产物利用Vazyme的ClonExpress重组试剂盒直接重组，反应30min后直接进行热击转化，挑取单克隆PCR检测，得到经过改造的pJG102载体PMMoV的CP基因替换为TMV的CP基因。阳性克隆提取质粒转农杆菌，按照实施例2中步骤3所述的方法进行PMMoV-GFP侵染性克隆Cre-LoxP重组系统体内重组。从图8可以看出，本氏烟在接种7天后系统叶出现荧光，负染电镜观察发现杆状病毒粒子，表明经改造的pJG102载体和pJM23载体以及pCre载体农杆菌介导法共转化本氏烟后，重组产生了具有侵染活性的病毒粒子，由此表明该侵染性克隆Cre-LoxP重组系统可以用于Tobamovirus属病毒基因功能的研究。上述载体改造成功仅需2天，大大缩短了构建时间。以Tobamovirus属病毒CP研究为例，本实验室构建PMMoV-GFP载体包含pCB301载体和PMMoV-GFP序列，大小分别为4591bp、7504bp，共12095bp，传统双酶切构建方式利用合适的酶切位点将PMMoV-GFP片段进行分段连接3-4段，需要构建T载体后将含有片段的T载体进行多次酶切连接，一次酶切连接需要3天时间，顺利将改造后的PMMoV-GFP构建完成，需要9-12天时间；如果使用Vazyme的ClonExpressMultiSOneStepCloningKit，需要将PMMoV-GFP拆分为3段进行重组但包含有CP的基因需要先做巢式PCR进行替换构建T载体后作为模板进行PCR扩增，每次改造均需进行PCR产物大小约为4.5kb、2.5kb、2.5kb、2.5kb的多片段重组，虽然一次重组时间仅为2天，但多个大片的重组的效率要低于小片段重组，成功构建可能需要进行多次重复实验，顺利将改造后的PMMoV-GFP构建完成，需要2-8天左右时间。而本案所提供的pJG102的CP基因序列替换，可以直接以pJG102为基础进行CP的替换，设计pJG102-Repfr，以及需要替换的序列Rep-TMVfr，直接通过Vazyme的ClonExpressIIOneStepCloningKit进行重组，完成约5.5kb与500bp的片段重组，几乎可以一次构建成功，2天即可完成，这极大的节约了改造时间以及成本。本发明通过改造pJG102载体即可实现CP基因的替换，而不需要利用PMMoV全序列进行替换，这极大地降低改造的难度，并且便于进行Tobamovirus属病毒基因功能的研究。表2引物序列表引物名称引物序列SEQIDNo.pJG102-RepfACATGATGGTGTAAATAAGTTGGSEQIDNo.21pJG102-ReprAGTTAAAACGTACTCGATGACGSEQIDNo.22Rep-TMVfCGTCATCGAGTACGTTTTAACTATGCCTTATACAATCAACTCTCSEQIDNo.23Rep-TMVrCCAACTTATTTACACCATCATGTCTAAGTAGCCGGAGTTGTGGSEQIDNo.24综上所述，利用本发明所提供的PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统，我们可以利用该重组系统的各拆分载体进行基因的替换等改造，而不需要利用PMMoV的全序列进行改造，这极大地降低了基因改造的难度。本发明提供了一种可以简单、有效地对目的基因组进行遗传修饰和改造的方法，通过本发明所提供的重组系统不仅能够有效的缩短基因改造的时间，大量节省相关试剂耗材和改造成本，并且可以利用该系统进行相关基因的功能研究，促进相关基因功能的开发。序列表宁波大学、浙江省农业科学院辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统及其应用18-100070-000052622018-05-3024SIPOSequenceListing1.017504DNA人工序列ArtificialSequence1gtaaatttttcacaatttaacaacaacaacacaaacaacaaacaacattacaaacaaatt60acaactacaatggcttacacacaacaagctaccaacgccgcattagcaagtactctccga120gggaacaaccccttggtgaacgatcttgctaatcggagactgtacgaatcagcggtcgaa180caatgcaatgcacatgaccgcaggcccaaggttaattttttaaggtcgataagcgaagag240cagacgcttatcgcaactaaggcctaccctgagttccaaattacgttctacaacacgcag300aacgctgtgcacagtctcgcaggtggacttcggtctttggaactagaatacttgatgatg360cagatcccctatggttcaacgacatacgatatcgggggaaattttgctgctcacatgttt420aaaggtcgtgactacgttcattgttgcatgcctaatatggacttacgtgacgtcatgcgt480cacaatgctcaaaaggatagcattgaactgtacctttcaaagcttgcgcaaaagaaaaag540gtaataccgccatatcaaaagccagtctttgataaatacacggacgatccgcaatcggta600gtgtgctcgaaacctttccagcactgcgaaggcgtttcgcactgcacggataaagtatac660gctgtcgctttgcacagtttatacgacattccagcagatgaatttggtgcagcacttctg720aggagaaatgttcatgtctgttatgctgccttccacttttctgagaatcttcttttagaa780gattcgtatgttagtcttgacgacataggcgctttcttctcgagagagggtgatatgttg840aacttttcctttgtagcagagagtactttaaattatactcattcctatagtaatgtgctt900aagtatgtgtgtaagacttacttccccgcttctagtagagaagtgtacatgaaggagttt960ttggtaactagggtaaatacttggttttgtaagttttcaaggttagatacctttgtacta1020tatagaggtgtgtaccacagaggtgtagacaaggagcaattttatagtgcaatggaagat1080gcttggcattacaaaaagactttggcgatgatgaatagcgaaaggatcctcttggaggat1140tcatcgtctgttaattattggtttccaaagatgaaagatatggtgatagtacctttgttc1200gacgtatctttacagaacgaggggaaaaggttagcaagaaaggaggttatggtcagcaag1260gacttcgtttatactgtgcttaatcatattcgcacataccagtcgaaagcgcttacttac1320gccaatgtattatcgttcgttgagtcgataagatcaagagtgataattaatggggtgact1380gctcgctcagagtgggatgtggacaaggctttgttgcagtctctgtcaatgacctttttc1440ttgcagaccaaattggccatgctcaaagatgacctcgtggttcaaaaatttcaagtgcat1500tctaaatcgctcactgaatatgtctgggatgagattactgccgcttttcacaactgtttt1560cctacaatcaaggagaggttgattaacaagaaactcataactgtttcggaaaaggctctt1620gaaattaaagtacctgacttatatgtgactttccacgacagattagttaaagagtacaag1680tcttcagtggaaatgccggtactggacgttaaaaagagcttggaagaagcggaagtgatg1740tacaatgctttgtcagaaatctcaattcttaaggatagtgacaagtttgatgttgatgtt1800ttttcccgaatgtgtaatactttaggcgtagatccattggtggcagcaaaggtaatggta1860gccgtggtttcaaatgagagtggtttgaccttaacgtttgagcggcctaccgaagcaaat1920gtcgcacttgcattgcaaccgacaattgcatcaaaggaggaaggttcattaaagattgtg1980tcgtcagacgtaggtgagtcctcaatcaaggaagtggtccgaaaatcggagatttctatg2040ctaggtctaacaggcagcacagtgtccgatgagttccaaagaagtacagaaatcgagtcg2100ttgcagcagttccatatggtatccacagagacgattatccgtaaacagatgcatgcgatg2160gtgtatactggtccgctaaaagttcaacaatgcaagaactatttagacagcctagtagcc2220tcgctctctgctgcggtatcaaacctgaagaagataatcaaggacacagctgcgatagat2280ctcgagactaaggaaaaatttggagtctacgacgtgtgccttaagaaatggttggtgaaa2340cctcaatcgaaaggacatgcttggggtgtggtgatggactcagactataagtgctttgta2400gcgcttctcacatacgatggcgagaacattgtgtgcggagagacatggcgtagagtcgca2460gtgagctccgaatctttggtgtattcagatatggggaagataagagctatacgctcagtg2520cttaaagacggtgaaccccatataagtagtgcaaaggttacacttgttgatggtgttcca2580ggttgcgggaagacaaaggagattctttcgagggtcaactttgacgaagatctggttcta2640gtaccaggaaaacaggctgccgaaatgataaaaagaagagcaaacagttctggtttaatc2700gtggcgaccaaggagaacgtaaggacggtagactctttcttaatgaattacggtcgaggt2760ccgtgccaatacaaaaggctgtttctggatgaaggtctaatgttacaccccggttgtgtt2820aattttctggttggcatgtctctatgctccgaggcttttgtttatggagacacccagcag2880attccttacatcaacagagttgcaacttttccctatcctaagcatttgagtcaactcgag2940gtcgatgctgttgagactcgcagaacaacattgcggtgtccggctgatatcaccttcttc3000ttgaatcagaagtacgaagggcaagttatgtgcacatcaagtgttacacgctcggtgtca3060cacgaggtcatccaaggtgcagcagtaatgaatccagtgtctaaaccacttaaagggaag3120gtgattacattcactcaatcagacaagtcattgctgctctcaaggggttacgaagatgtg3180cataccgttcatgaggtgcaaggggaaacgtttgaagacgtctcattagtgagattgacg3240cctacacccgtgggaataatttcaaagcagagtccgcacctgttggtctcgttgtctagg3300catacaaggtcaatcaaatattacactgttgtactagatgcagtcgtttcagtgcttaga3360gatttggagtgtgtgagtagttacctgttagatatgtacaaagttgatgtgtcgactcaa3420tagcaattacagatagaatcggtgtacaaaggtgttaaccttttcgtcgcagccccgaaa3480acaggagatgtttctgacatgcaatattactatgacaagtgtttgccgggaaacagtact3540atacttaatgagtatgatgctgtaactatgcaaatacgagaaaataatttgaatgtcaag3600gattgtgtgttggatatgtcgaagtcggtgcctcttccgagagaatctgagacgacattg3660aaacctgtgatcaggactgctgctgaaaaacctcgaaaacctggattgttggaaaacttg3720gtcgcgatgatcaaaagaaatttcaactctcccgaattaataggggtcgtcgacatcgaa3780gacaccgcttctctagtagtagataagttttttgatgcatactttattaaagaaaagaaa3840aaacctaaaaatatacctctgctttcaagggcgagtttggaaagatggatagaaaagcaa3900gaaaagtcgacgattggccagttggctgattttgactttattgatcttccagccgttgat3960caatataggcacatgatcaagcagcagccgaaacagcgtctagatcttagtattcaaact4020gaatacccggctttgcaaactattgtgtatcatagcaagaaaatcaatgcgctttttggt4080cctgtattttcagaattaacaagacaactgctagagtcaattgacagttcgagattcatg4140ttttatacaaggaaaacgcctacacagatcgaagagtttttctcagatctggactctaat4200gttcctatggacatattagagctggacatttccaagtatgacaaatcacagaacgaattt4260cattgtgcagttgagtatgagatttggaaaaggttaggcttagacgatttcttggccgaa4320gtttggaaacacgggcatcggaagac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权利要求：1.一种辣椒轻斑驳病毒PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统，其特征在于，所述Cre-LoxP重组系统包括pJM23载体、pJG102载体和pCre载体。2.根据权利要求1所述的Cre-LoxP重组系统，其特征在于，所述pJM23载体由PMMoV-GFP侵染性克隆序列的RdRpp126p183以及MP部分序列融入pCB301构建得到，其3’末端引入内含子前半部分序列5’-gtaggtttcattttcataattacacaaatttagatttgatttttgtt-3’及LoxP序列5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’，所述pJM23载体的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示。3.根据权利要求1所述的Cre-LoxP重组系统，其特征在于，所述pJM102载体由PMMoV-GFP侵染性克隆序列的MP另一部分序列、GFP、CP融入pCB301构建得到，其5’末端引入内含子后半部分序列5’-ttttattacatgtttgaacttcaacaatttatgactttttgttcttattgttgcag-3’及LoxP序列5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’，所述pJM102载体的核苷酸序列如SEQIDNo.15所示。4.根据权利要求1所述的Cre-LoxP重组系统，其特征在于，所述pCre载体由Cre序列融入双元表达载体构建得到。5.根据权利要求1所述的PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统，其特征在于，所述重组系统的构建方法包括以下步骤：1获得PMMoV-GFP侵染性克隆的核苷酸全序列；2设计引物pJM23-1fr，pJM23-2fr，pCB301-fullfr，扩增引入LoxP序列的目的片段，利用Vazyme的ClonExpressMultiSOneStepCloningKit将PCR扩增获得的pJM23-1、pJM23-2、pCB301-full片段直接重组构建成pJM23载体；3设计引物pJG102fr，pCB301-102fr，扩增引入LoxP序列的目的片段，利用Vazyme的ClonExpressIIOneStepCloningKit将PCR扩增获得的pJG102、pCB301-102将pCB301缺失35S启动子片段直接重组构建成pJG102载体；4设计引物pCrefr扩增Cre基因片段，利用XbaI和SacI双酶切后连入双元表达载体构建得到pCre载体；5将上述三种载体采用农杆菌介导法共转化本氏烟，体内Cre基因表达后获得重组的PMMoV-GFP侵染性克隆；其中，所述引物的碱基序列如SEQIDNo.2～SEQIDNo.13所示。6.一种辣椒轻斑驳病毒PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统，其特征在于，所述Cre-LoxP重组系统包括pJM23载体和pGJ2303载体。7.根据权利要求6所述的Cre-LoxP重组系统，其特征在于，所述pJM23载体由PMMoV-GFP侵染性克隆序列的RdRpp126p183以及MP部分序列融入pCB301构建得到，其3’末端引入内含子前半部分序列5’-gtaggtttcattttcataattacacaaatttagatttgatttttgtt-3’及LoxP序列5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’，所述pJM23载体的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示；所述pJG2303载体由pJG102载体和35S-Cre-RZ-NOS融合而成，其核苷酸序列如SEQIDNo.16所示。8.根据权利要求6所述的PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统，其特征在于，所述重组系统的构建方法包括以下步骤：1获得PMMoV-GFP侵染性克隆的核苷酸全序列；2设计引物pJM23-1fr,pJM23-2fr,pCB301-fullfr，扩增引入LoxP序列的目的片段，利用Vazyme的ClonExpressMultiSOneStepCloningKit将PCR扩增获得的pJM23-1、pJM23-2、pCB301-full片段直接重组构建成pJM23载体；3设计引物pJG2303fr，pCB301-full-RHfr，扩增将35S-Cre-RZ-NOS序列利用Vazyme的ClonExpressIIOneStepCloningKit引入pJG102载体，重组构建得到pJG2303载体；4将上述两种载体采用农杆菌介导法共转化本氏烟，体内Cre基因表达后获得重组的PMMoV-GFP侵染性克隆；其中，所述的pJG2303载体构建的引物的碱基序列如SEQIDNo.17～SEQIDNo.20所示。9.一种权利要求1所述的PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统的应用，其特征在于，通过将pJG102载体中PMMoV的CP基因替换为烟草花叶病毒TMV的CP基因，农杆菌介导法共转化本氏烟后产生了具有生物活性的PMMoV-GFP侵染性克隆。

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