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申请/专利权人：山西医科大学

摘要：本发明公开了一种改善免疫微环境促进移植后hESC‑RPE存活的方法，hESC‑RPE移植后年龄相关性黄斑变性患者房水的收集及蛋白组学分析，包括将3名AMD患者纳入AMD组，3名年龄相当的白内障患者纳入正常对照组，4名需接受手术治疗的AMD患者纳入术前组，hESC‑RPE手术移植后将其纳入术后组；分别收集4组病人的房水，并对房水组分进行蛋白组学分析，抑制外泌体的分泌，可有效延长移植后hESC‑RPE的存活，增强hESC‑RPE的移植疗效，为提高hESC‑RPE移植疗效提供了一条新思路和临床可行性。因此，其可作为药物靶点或基因治疗的靶点开发新型药物或生物制剂。这有望为hESC‑RPE移植治疗视网膜退行性疾病提高长期疗效。

主权项：1.一种改善免疫微环境促进移植后hESC-RPE存活的方法，hESC-RPE移植后年龄相关性黄斑变性患者房水的收集及蛋白组学分析，其特征在于，包括将3名AMD患者纳入AMD组，3名年龄相当的白内障患者纳入正常对照组，4名需接受手术治疗的AMD患者纳入术前组，hESC-RPE手术移植后将其纳入术后组；分别收集4组病人的房水，并对房水组分进行蛋白组学分析，具体步骤包括：步骤一：hESC-RPE的培养；1完全培养基配制：80％KnockoutCTSDMEM+20％KnockoutserumKOSR+1％MEMNEAA+1％Glutmax+1％青链-庆大霉素+1‰巯基乙醇，将培养基混合后经由0.22μm滤头过滤；2以无菌PBS配制1％人重组玻连蛋白rh-VTN预包被T75培养瓶，37℃孵育40分钟；3将hESC-RPE以105个cm2的密度接种到T75培养瓶中，补充培养基到8mL，细胞置于37℃，5％CO2条件的恒温孵箱当中培养，隔天换液；步骤二：GW4869预处理hESC-RPE；1将10μM的DMSO或GW4869加入hESC-RPE培养基内，培养24h，获取hESC-RPE衍生外泌体，具体步骤如下：将KOSR以100000×g离心不短于12h，弃去管底约1cm液体，上层液体即EXO-Depleted-KOSR，以EXO-depleted-KOSR替代KOSR，按照上述方案配制无外泌体培养基；光学显微镜下观察到hESC-RPE融合度到约80％，使用无菌PBS轻柔洗涤细胞3次，弃去PBS；将培养基替换为无外泌体培养基，培养48小时后收集细胞上清，一周内储存4℃冰箱；细胞上清预处理：将细胞上清以300×g，4℃，10min；2000×g，4℃，10min；10000×g，4℃，30min连续梯度离心，去除细胞碎片、细胞外囊泡等杂质，以0.22μm滤头过滤去除较小杂质；将经过预处理的细胞上清以100000×g，4℃，70min条件离心，获得沉淀，去除上清液，以PBS重悬沉淀，重复以100000×g，4℃，70min条件离心，将最后得到的沉淀以100μL无菌PBS重悬，置于-80℃储存备用；2WesternBlot检测外泌体表面标志蛋白CD9，CD63，TSG101的表达水平，具体步骤如下：将外泌体从-80℃中取出，置于4℃冰箱融化，向外泌体中加入总体积1％的蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂并混合均匀，再加入等体积RIPA裂解液，于冰上裂解30分钟，14000×g，4℃，10min条件下离心，将上清转移到新的洁净无酶EP管中；按照BCA试剂说明书测定各组蛋白样品浓度，按照蛋白样品体积：蛋白上样缓冲液5×体积＝4:1比例稀释样品，并置于金属浴中100℃加热变性10min，冷却后保存于-80℃备用；按照说明书配制10％SDS-PAGE分离胶；加入TEMED后立即混匀并将胶液灌注到玻璃夹板中，并轻柔在界面上倒入乙醇，室温放置40min，待分离胶凝固后轻轻倒掉乙醇；按照说明书配制配制5％SDS-PAGE浓缩胶；加入TEMED后立即混匀，并将胶液灌入分离胶上层，迅速将梳子插入浓缩胶中，室温放置30min，待浓缩胶凝固后，轻柔拔出梳子，将玻璃夹板拆下组装到已经装有电泳液的电泳仪中；每一个梳孔以15μg蛋白量上样，80V恒压电泳至样品到达浓缩胶和分离胶界面，转为110V恒压直至溴酚蓝条带到达分离胶下边缘约0.5cm处，停止电泳；在已经预冷的转膜缓冲液中切去凝胶多余部分，裁剪出一张大小与凝胶相似的PVDF膜，以无水甲醇激活30s后，置于预冷的转膜缓冲液中备用；将凝胶、PVDF膜、厚滤纸及海绵按照黑胶白膜的规则组装成经典“三明治”结构夹紧，整个过程中不断用圆柱状离心管或玻璃棒去除气泡；将“三明治”夹板放入已经装有预冷过转膜缓冲液电转仪中，以300mA恒流转膜90min，期间保持整个电转系统处于冰浴环境中，电转结束后取出PVDF膜；TBST洗膜，5min，3次，再将PVDF膜转移到预先配制好的5％BSA溶液中，室温放置于摇床上封闭2h；以1：500分别稀释CD81，CD9和TSG101，4℃，孵育，过夜；弃一抗，室温摇床上以TBST洗膜3次，每次10min，将洗涤后的PVDF膜转移到抗体稀释液配制的HRP二抗中，置于摇床上室温避光孵育2h；弃二抗，室温摇床上以TBST洗膜3次，每次10min，配制ECL显影液，于Bio-rad凝胶成像系统采集记录数据；3纳米粒度追踪检测外泌体大小及浓度，将外泌体沉淀稀释重悬于2ml无菌预冷的PBS中，将稀释后的样品通过注射器上样到样品池中，然后仪器在整个样品池的11个不同位置测量每个样品，每个位置有两个读数周期；在对所有11个位置进行自动分析并去除所有异常位置之后，通过优化的机器软件计算出平均，中位数和众数以直径表示大小以及样品浓度；步骤三：siRNA转染抑制hESC-RPE内Rab27a表达；1siRNA的转染；包装、构建靶向Rab27a的siRNA的慢病毒。选择对数生长期的细胞，以2×105mL接种细胞至六孔板中，37℃培养16-24h，至细胞汇合度为20％-30％。次日，显微镜下观察细胞密度，加入病毒液，然后轻轻晃动六孔板，放入培养箱继续培养；2RT-PCR检测hESC-RPE内Rab27a的基因表达水平；3纳米粒度追踪检测外泌体大小及浓度。

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