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申请/专利权人：福州大学

摘要：本发明提供了一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法。本发明基于使用回文探针引发的三维自组装DNA纳米结构，结合热稳定连接酶的高保真度和电化学测量的先天优势，设计了一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法，利用该制备方法制得的电化学生物传感器具有设计简单、通用性好、仪器便宜、测定特异性高和灵敏度高的优点。

主权项：1.一种回文核酸纳米片超灵敏电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）将裸金电极用氧化铝抛光粉打磨至表面光洁，在去离子水中超声洗涤，将洗涤后的金电极浸入新配置的Piranha溶液中以消除有机污染，再使用去离子水对金电极进行清洗，室温晾干，即得预处理后的金电极；在预处理后的金电极表面滴加10μL1μM的硫醇化捕获探针以完全覆盖金电极工作界面，并在室温下、水饱和的气氛中孵育12h，再用超纯水洗涤金电极，然后采用6-巯基-1-己醇封闭电极表面非特异性吸附位点，即得探针修饰的工作电极；2）将10μL目标探针滴加到步骤（1）所得的探针修饰的工作电极的表面，并在室温下孵育1h，随后将工作电极置于0.1MpH7.4PBS缓冲液中搅拌清洗；在洗涤后的电极表面继续滴加10μL1μM的触发探针并在室温下孵育1h，再将工作电极置于0.1MpH7.4PBS缓冲液中搅拌清洗；在洗涤后的工作电极表面滴加10μL10U的TaqDNALigase，在室温下反应2h；反应结束后，将工作电极在95℃热水中浸泡5min以热释放目标DNA，然后转移到另一管相同温度的水中，然后逐渐冷却至室温；目标DNA杂交-连接-热释放的过程共进行三次；3）将10μL1μM的回文探针1与等量等浓度的回文探针2混合均匀并滴在步骤（2）处理好的工作电极表面，然后在室温下孵育2h；孵育结束后，使用0.1MpH7.4PBS缓冲液洗涤工作电极，随后将亚甲蓝滴加到工作电极表面并在室温下孵育40min，即获得待测的工作电极；4）使用0.1MpH7.4PBS缓冲液洗涤待测工作电极，然后以饱和甘汞电极作为参比电极，以铂丝作为辅助电极，组成三电极体系，并将三电极体系置于工作溶液中，在电化学工作站上做循环伏安扫描，收集产生的电化学信号；所述回文探针1核苷酸序列为：5’-CCGTACGGTTTCGTCGTGCAGCAGCAGCAGCAGCAACGGCTTGCTGCTGCTGCTGCTGC-3’；所述回文探针2核苷酸序列为：5’-TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGCCGTTTTGATCGATC-3’；当所述目标探针核苷酸序列为5’-GGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGG-3’时，所述硫醇化捕获探针核苷酸序列为：5’-P-CGCACCTCAAAGCTGTTCCTTTTTTTTTT-SH-3’，所述触发探针核苷酸序列为：5’-TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGCCCAGGACAGGCACAAACA-3’；当所述目标探针核苷酸序列为：5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCC-3’时，所述硫醇化捕获探针核苷酸序列为：5’-P-CCAGCTCCAACTACCACAATTTTTTTTTT-SH-3’，所述触发探针核苷酸序列为：5’-TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGGGCACTCTTGCCTACGCCA-3’。

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