买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：首都医科大学附属北京安定医院

摘要：本发明属于生物技术领域，公开了一种测定BACE1酶切α‑Klotho活性的检测方法，其步骤为：S1、判断是否发生酶切反应；S2、寻找酶切位点；S3、确定酶切位点；S4、验证酶切位点；S5、酶切活性检测。并公开了一种测定BACE1酶切α‑Klotho活性的试剂盒，包括底物储存液、醋酸钠缓冲液和重组人BACE1酶；所述底物储存液中的底物为Abz‑GIEFMEAEK‑Dnp‑NH2、Abz‑ETNLQTAPK‑Dnp‑NH2、Abz‑EVKMDAEFK‑Dnp‑NH2、Abz‑SEVNLDAEFRK‑Dnp‑NH2或Abz‑PEEFTVCTK‑Dnp‑NH2；所述醋酸纳缓冲液的组成成分为50mMHOAc和100mMNaCl，用NaOH溶液调整pH＝4.0。本发明证实了α‑Klotho确实是BACE1酶切底物，鉴定出了具体的酶切位点为F‑T，并开发了测定BACE1酶切α‑Klotho活性的检测方法及其试剂盒。

主权项：1.一种测定BACE1酶切α-Klotho活性的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、判断是否发生酶切反应使用α-Klotho蛋白与BACE1酶进行酶切反应，并且判断是否发生了酶切反应；S2、寻找酶切位点若步骤S1发生了酶切反应，利用软件对BACE1已知底物的切割位点进行汇总分析，使用Macscot软件对BACE1理论的酶切位点进行预测，并将提取的序列信息输入WebLogo3.7.4程序生成序列标志；根据BACE1酶切α-Klotho蛋白反应产生的新条带的分子量大小，以及BACE1通常在靠近细胞膜的位置切割底物的特点，选择靠近跨膜区的41个氨基酸序列设计并合成多肽KL941-981；用0.1μgμL的KL941-981与0.1μgμL的BACE1在pH＝4.0的0.1M醋酸钠缓冲液中，室温孵育24小时进行酶切反应，酶切反应后得到多肽混合物，最后，将酶切产物的测序结果与KL941-981序列进行比对；合成肽段KL941-981与BACE1反应后，用MALDI-TOF质谱分析反应混合物；S3、确定酶切位点使用Psipred4.0软件对α-Klotho进行蛋白质二级结构的预测，排除可能对酶切反应有影响的二级结构序列，，删减了在二级螺旋结构的10个氨基酸序列，重新设计了包含酶切位点的优化肽段KL951-981，用0.1μgμL的优化肽段KL951-981与0.1μgμLBACE1在pH＝4.0的0.1M醋酸钠缓冲液中，室温孵育24小时，用MALDI-TOF质谱分析，然后将质谱测序结果与重组KL951-981序列进行比对；S4、验证酶切位点将鉴定出的酶切位点进行突变得突变肽段，突变肽段与肽段KL951-981的长度相同，使用突变肽段与BACE1再次进行酶切反应和质谱测序分析，如果不能被切割，证明酶切位点的特异性；S5、酶切活性检测将重组人BACE1酶加入96孔黑色避光板中，在避光环境下，按体积比为1:1的比例加入底物反应缓冲液；酶标仪参数设置：反应温度37℃，激发波长320nm,发射波长420nm,标准模式下设置增益值60-75；酶标仪记录30-60分钟内荧光信号强度，至少收集30分钟内的数据用于后续分析；在酶标仪配套软件中完成数据统计，收集每个样本前5-10分钟的Vmax；所述醋酸纳缓冲液的组成成分为50mMHOAc和100mMNaCl，用NaOH溶液调整pH＝4.0；所述底物反应缓冲液的浓度为40-120μM，所述底物缓冲液由DMSO配制的2mM底物储存液经加入所述醋酸钠缓冲液稀释而得；所述底物反应缓冲液中的底物为Abz-GIEFMEAEK-Dnp-NH2、Abz-ETNLQTAPK-Dnp-NH2、Abz-EVKMDAEFK-Dnp-NH2、Abz-SEVNLDAEFRK-Dnp-NH2或Abz-PEEFTVCTK-Dnp-NH2。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 首都医科大学附属北京安定医院 一种测定BACE1酶切α-Klotho活性的检测方法及其试剂盒