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申请/专利权人：北京利德曼生化股份有限公司

摘要：本发明为一种快速定量检测全血中BNP的微流控荧光免疫芯片，包括中心板和底板，所述中心板和所述底板围绕此凹部彼此相叠的区域通过激光焊接来直接地并且以流体密封方式彼此结合，样本流道与所述测量格呈流体接触并且在所述样本流道上设有用于溶解示踪试剂的示踪区、两个样本混合区域、液体检测监控区域、样本流道端部有样本废料区域，在测量格对应位置的中心板上设置捕获区；所述芯片示踪区预先封装示踪试剂，所述示踪试剂包括用荧光激发波长为610‑660nm的荧光染料标记的BNP单克隆抗体和用荧光激发波长为610‑660nm的荧光染料标记的质控物；所述捕获试剂包括BNP单克隆抗体和质控物单克隆抗体。芯片最小检测限不高于2pgmL，检测范围为2～5000pgmL。

主权项：1.一种快速定量检测全血中BNP的微流控荧光免疫芯片，包括中心板和底板，所述中心板和所述底板围绕此凹部彼此相叠的区域通过激光焊接来直接地并且以流体密封方式彼此结合，样本流道与测量格呈流体接触并且在所述样本流道上设有用于溶解示踪试剂的示踪区、两个样本混合区域、液体检测监控区域、样本流道端部有样本废料区域，在测量格对应位置的中心板上设置捕获区；其特征在于，所述芯片示踪区预先封装示踪试剂，所述示踪试剂包括用荧光激发波长为610-660nm的荧光染料标记的BNP单克隆抗体和用荧光激发波长为610-660nm的荧光染料标记的质控物；捕获试剂包括BNP单克隆抗体和质控物单克隆抗体；所述捕获试剂通过使用高精度点样仪，以每滴450pL的液滴喷在芯片的捕获区内，喷点形成5个等间距的6*7矩形点阵，喷点不相互重合；捕获区BNP单克隆抗体的浓度为1.0mgmL；捕获区质控物单克隆抗体的浓度为1.0mgmL；所述荧光染料为Cy5花菁染料；所述示踪试剂通过使用高精度点样仪，均匀的将示踪试剂喷涂在芯片的示踪区，形成两条平行的直线，示踪剂体积为6μL；所述示踪区Cy5系列花菁染料标记的BNP单克隆抗体浓度为1.25μgmL；所述示踪区质控物浓度为0.5μgmL；所述示踪试剂还包括动物蛋白、表面活性剂、异噬性抗体阻断剂、防腐剂和缓冲液；所述捕获试剂还包括缓防腐剂和缓冲液；动物蛋白为质量百分比浓度为0.1％的牛血清白蛋白，表面活性剂为质量百分比浓度为0.01％的TritonX-100，异嗜性抗体阻断剂浓度为50μgmL，防腐剂为质量百分比浓度为0.1％的叠氮化钠，缓冲液为pH为7.2的PBS缓冲液；示踪试剂中Cy5标记的BNP单克隆抗体的制备方法是：1将BNP单克隆抗体采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析；2采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.2-1mgmL的Cy5荧光素溶液；3向Cy5荧光素溶液中加入NHS或EDC，活化1h；4向步骤1处理后的BNP单克隆抗体中加入步骤3制备的Cy5荧光素溶液，Cy5荧光素比BNP单克隆抗体的摩尔比为7:1，混匀，室温反应24h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得；Cy5标记的质控物的制备方法是：1采用10mMPBS缓冲液配制5～10mgmL的BSA溶液；2向BSA溶液中加入SMCC，活化1h；3用PD10柱子纯化得活化的BSA溶液；4向步骤3活化后的BSA溶液中加入待标记质控物，按照BSA溶液比质控物摩尔比1.5:1投料，混匀，室温反应6h；然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析，并浓缩至2～4mgmL，得到浓缩液；5采用0.2M的碳酸氢钠溶液配制0.1-1mgmL的Cy5荧光素溶液；6向Cy5荧光素溶液中加入NHSEDC，活化1h；7向步骤4浓缩液中加入步骤6制备的Cy5荧光素溶液，按照荧光素比浓缩液摩尔比5:1投料，混匀，室温反应20-24h，然后采用pH为9.0的碳酸盐缓冲液过夜透析即得；芯片与ResponseIQ联用，芯片最小检测限不高于2pgmL，检测范围为2～5000pgmL，芯片检测样本的体积为50μL，检测时间为10min，批内变异系数小于±10％，批间变异系数小于±15％。

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