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申请/专利权人：云南伦扬科技有限公司

摘要：本发明公开了一种碳点模拟酶结合荧光探针检测多巴胺的方法。本发明采用氯化胆碱尿素共晶试剂及氨基酸为碳源，水热法合成氯氮掺杂荧光碳点（N,Cl‑CDs），基于N,Cl‑CDs的催化活性，催化氧化多巴胺产生聚多巴胺，聚多巴胺对酵母碳点产生荧光猝灭作用，建立多巴胺检测新方法，检出限为0.002μM。将本方法应用于血浆及尿液中多巴胺的检测分析，结果与标准方法相符。方法具有灵敏度高、特异性的特点、操作简单、快速等特点。

主权项：1.一种碳点模拟酶结合荧光探针检测多巴胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：1将纳米模拟酶氯氮掺杂碳点加入多巴胺溶液中，用磷酸盐控制pH8.0，30-35℃反应30-40min，生成聚多巴胺；2在生成聚多巴胺溶液中，加入酵母碳点产生荧光线性猝灭，从而建立多巴胺间接检测新方法；其中，所述的氯氮掺杂碳点由以下方法制备得到：①取0.4-1份尿素，1-3份氯化胆碱及0.4-1份甘氨酸，溶于100-120份去离子水中，超声溶解；置于聚四氟乙烯内衬水热反应釜中，180℃恒温加热8～10h，反应完成后自然冷却至室温；②将所得溶液10000rmin下离心10-15min，0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3000-3500Da的透析袋进行透析处理24h，得到水溶性氯氮掺杂碳点；其中，所述的酵母碳点由以下方法制备得到：①取2-5份酵母粉，溶于100-120份去离子水中，超声溶解；置于聚四氟乙烯内衬水热反应釜中，200℃恒温加热24h，反应完成后自然冷却至室温；②将所得溶液10000rmin下离心10-15min，0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3000-3500Da的透析袋进行透析处理24h，得到水溶性酵母碳点；所述的酵母碳点最大激发波长为320nm，最大发射波长为404nm；所述纳米模拟酶氯氮掺杂碳点与多巴胺重量比为1:300-350。

全文数据：一种碳点模拟酶结合荧光探针检测多巴胺的方法技术领域本发明涉及化学分析检测技术领域，具体为一种碳点模拟酶结合荧光探针检测多巴胺的方法。背景技术多巴胺（DA）是人体大脑分泌的儿茶酚胺类神经传递介质，在一定程度上可以协调垂体分泌激素的机能。多巴胺是对心血管类疾病具有显著疗效的药物，它可以使心脏保持兴奋、增强心脏肌肉的收缩、扩张人体内脏的血管、增加肾血流量，从而治疗突发性心肌梗塞、支气管哮喘、肾功能衰竭以及感染性、失血性及心源性休克。多巴胺对于精神分裂症、帕金森综合症等多种精神类疾病发病原因的研究以及辅助治疗具有重要的意义。鉴于上述原因，探索并创新多巴胺的分析检测手段在神经系统生理机能的研究、相关精神性疾病的诊断与药物质量剂量的控制等领域具有重要的应用价值。碳纳米材料模拟酶相比于其他纳米模拟酶，合成成本低，生物相容性好，在实际应用中存在较大的价值，因此研究出具有优良纳米结构的碳纳米模拟酶是十分的有意义和有应用前景。碳纳米材料模拟酶中的碳纳米粒子由于尺寸小，环保，又有独特的发光性能，更是成为广大科研工作者的研究对象。碳点CDs是一种生物相容性好、毒性低或没有毒性的纳米材料，在化学分析、生物成像和光催化等研究领域得到了广泛应用。钟青梅等研究了一种以CDs为模拟酶的葡萄糖测定新方法，展现CDs作为模拟酶的应用前景。本发明采用氯化胆碱尿素共晶试剂及氨基酸为碳源、氮源及氯源，水热法合成氯氮掺杂荧光碳点（N,Cl-CDs），基于N,Cl-CDs的催化活性，催化氧化多巴胺产生聚多巴胺，聚多巴胺对酵母碳点产生荧光猝灭作用，建立多巴胺检测新方法，检出限分别为碳点模拟酶结合荧光探针检测多巴胺的方法。将本方法应用于血浆及尿液中多巴胺的检测分析，结果与标准方法相符。方法具有灵敏度高、特异性的特点、操作简单、快速等特点。发明内容本发明的目的在于提供一种碳点模拟酶结合荧光探针检测多巴胺的方法，利用氯氮掺杂碳点对多巴胺的模拟酶催化作用，酵母碳点对聚多巴胺的荧光猝灭作用，建立多巴胺荧光检测新方法。一种碳点模拟酶结合荧光探针检测多巴胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将纳米模拟酶氯氮掺杂碳点加入多巴胺溶液中，用磷酸盐控制pH8.0，30-35℃反应30-40min，生成聚多巴胺；（2）在生成聚多巴胺溶液中，加入酵母碳点产生荧光线性猝灭，从而建立多巴胺间接检测新方法。所述的氯氮掺杂碳点由以下方法制备得到：（1）取0.4-1份尿素，1-3份氯化胆碱及0.4-1份甘氨酸，溶于100-120份去离子水中，超声溶解；置于聚四氟乙烯内衬水热反应釜中，180℃恒温加热8～10h，反应完成后自然冷却至室温。（2）将所得溶液10000rmin下离心10-15min，0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3000-3500Da的透析袋进行透析处理24h，得到水溶性氯氮掺杂碳点。所述的酵母碳点由以下方法制备得到：（1）取2-5份酵母粉，溶于100-120份去离子水中，超声溶解；置于聚四氟乙烯内衬水热反应釜中，200℃恒温加热24h，反应完成后自然冷却至室温；（2）将所得溶液10000rmin下离心10-15min，0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3000-3500Da的透析袋进行透析处理24h，得到水溶性酵母碳点。所述的酵母碳点最大激发波长为320nm，最大发射波长为404nm。所述纳米模拟酶氯氮掺杂碳点与多巴胺重量比为1：300-350。所述酵母碳点浓度为0.5-2.0gL，聚多巴胺浓度为0.01-100µM。本发明的优点在于：1.本发明利用碳点的模拟酶的催化作用及荧光探针作用，建立了双碳点体系用于多巴胺检测新方法。该方法采用一步水热法制备的氯氮掺杂荧光碳点，具有模拟酶的催化作用，酵母碳点具有荧光探针作用，通过酵母碳点对聚多巴胺的荧光猝灭作用，建立多巴胺荧光检测新方法。2、多巴胺通过氯氮掺杂荧光碳点模拟酶催化氧化得到聚多巴胺，及后续酵母碳点对聚多巴胺的荧光猝灭作用，表现出新方法的高灵敏度，检测限可以达到0.002µM，高特异性，可以用于生物基体中多巴胺检测。3、建立的多巴胺检测双碳点体系，具有方法操作简单、快速、灵敏度高、特异性强，有好的应用前景。附图说明图1为实施例1中酵母碳点的激发、发射光谱；图2、图3酵母碳点对聚多巴胺的荧光猝灭作用示意图谱，从图中可以看出，酵母碳点对聚多巴胺呈线性荧光猝灭，可用于间接多巴胺荧光探针检测。图4为共存的其他氨基酸及其他药物对酵母碳点的影响结果，从图中可以看出，酵母碳点对聚多巴胺有较好的选择特异性。具体实施方式下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例1：血液中多巴胺含量测定操作步骤如下：1、氯氮掺杂碳点制备：取0.4-1份尿素，1-3份氯化胆碱及0.4-1份甘氨酸，溶于100-120份去离子水中，超声溶解；置于聚四氟乙烯内衬水热反应釜中，180℃恒温加热8～10h，反应完成后自然冷却至室温；将所得溶液10000rmin下离心10-15min，0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3000-3500Da的透析袋进行透析处理24h，得到水溶性氯氮掺杂碳点。2、酵母碳点制备：取2-5份酵母粉，溶于100-120份去离子水中，超声溶解；置于聚四氟乙烯内衬水热反应釜中，200℃恒温加热24h，反应完成后自然冷却至室温；将所得溶液10000rmin下离心10-15min，0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3000-3500Da的透析袋进行透析处理24h，得到水溶性酵母碳点。3、聚多巴胺制备：取步骤1制备的0.1mgmL氯氮掺杂碳点0.5mL作为纳米模拟酶加入0.01、0.1、1.0、10.0、20.0、50.0、100.0mM多巴胺5mLpH8.0磷酸盐溶液中，30-35℃反应30-40min，生成聚多巴胺。4、多巴胺标准曲线制作：在步骤3得到的聚多巴胺系列浓度溶液中，依次加入50～100μL步骤2制备的酵母碳点，0.2molLpH7.0磷酸盐缓冲溶液1～2mL，蒸馏水稀释至5mL，摇匀后，在最大激发波长为320nm时，最大发射波长为404nm进行荧光检测（见图1），以多巴胺浓度为横坐标，I404为纵坐标，绘制标准曲线（见图2，图3），计算回归方程，相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1。5、方法特异性考察：图2是多巴胺浓度为0.5mM，多巴胺、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸、抗坏血酸、尿酸、葡萄糖、肌醇、乙酰胆碱、5-羟色胺、去甲肾上腺素及金属离子的浓度为5μgkg，分别加入硼硅掺杂碳点-罗丹明B溶液，仅有四环素有明显的猝灭作用，其他四环素类药物几乎没有猝灭作用，方法具有好的选择特异性；图3是克伦特罗浓度为0.5μgkg，天冬氨酸、谷氨酸、胱氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸、四环素及金属离子为5μgkg，分别加入酵母碳点，仅有聚多巴胺有明显的荧光猝灭作用，其他氨基酸及金属离子几乎没有猝灭作用，方法具有好的选择特异性。表1线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围6、血液样品中多巴胺测定：（1）样品处理：新鲜血液加抗凝剂后于3000rpm离心10min，取出血浆于4℃冰箱中保存待用，24h内进行分析。准确移取2mL血浆样品于10mL具塞塑料离心管中，加入4mL酸性乙腈后涡旋混合均匀1min，于50000rpm离心10min，取上清液供检测。（2）多巴胺测定：取上述步骤（1）的上清液1mL，按照步骤3、4相同测定条件催化氧化及测定荧光强度，分别代入步骤4回归方程，计算得出多巴胺的含量为未检出，进行样品加标回收率试验，相对标准偏差测定，结果见表2。实施例2：尿液中多巴胺的含量测定操作步骤如下：1、氯氮掺杂碳点制备：同实施例1；2、酵母碳点制备：同实施例1；3、聚多巴胺制备：同实施例1；4、多巴胺标准曲线制作：同实施例1；5、尿液中多巴胺的含量测定：（1）样品处理：准确移取5mL尿液样品于10mL具塞玻璃离心管中，加入0.2g活性炭并涡旋30s使其充分混匀。然后用定性滤纸过滤至10mL具塞玻璃管中用去离子水稀释至5mL，供检测。（2）多巴胺测定：取上述步骤（1）的脱色后的尿液1mL，按照步骤3、4相同测定条件催化氧化及测定荧光强度，分别代入步骤4回归方程，计算得出多巴胺的含量为未检出，样品加标回收率见表2。实施例3：多巴胺注射剂样品中多巴胺测定：1、氯氮掺杂碳点制备：同实施例1；2、酵母碳点制备：同实施例1；3、聚多巴胺制备：同实施例1；4、多巴胺标准曲线制作：同实施例1；5、多巴胺注射剂含量测定：将盐酸多巴胺注射剂开瓶后，定容至500mL容量瓶中,再取1.00mL定容至100mL容量瓶中,取一定样品按照步骤3、4相同测定条件催化氧化及测定荧光强度，分别代入步骤4回归方程，计算得出多巴胺的含量54.73mM，样品加标回收率见表2。实施例4：参附强心颗粒中多巴胺的含量测定：1、氯氮掺杂碳点制备：同实施例1；2、酵母碳点制备：同实施例1；3、聚多巴胺制备：同实施例1；4、多巴胺标准曲线制作：同实施例1；5、尿液中多巴胺的含量测定：精密称取参附强心颗粒0.1000g，加pH等于1的盐酸水100mL超声溶解，得到质量浓度为1.00mgmL供试品浓溶液。取适量供试品溶液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液1.0mL，稀释至1000mL，得到供试品溶液，取1mL，按照步骤3、4相同测定条件催化氧化及测定荧光强度，分别代入步骤4回归方程，计算得出多巴胺的含量为25.8µM，样品加标回收率见表2。表2空白样品中的加标回收率n=3由表2结果可知：用本发明碳点模拟酶结合荧光探针检测多巴胺的方法，具有回收率及精密度高的特点，表明方法具有好的准确性及可靠性。

权利要求：1.一种碳点模拟酶结合荧光探针检测多巴胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将纳米模拟酶氯氮掺杂碳点加入多巴胺溶液中，用磷酸盐控制pH8.0，30-35℃反应30-40min，生成聚多巴胺；（2）在生成聚多巴胺溶液中，加入酵母碳点产生荧光线性猝灭，从而建立多巴胺间接检测新方法。2.根据权利要求1所述的碳点模拟酶结合荧光探针检测多巴胺的方法，其特征在于：所述的氯氮掺杂碳点由以下方法制备得到：（1）取0.4-1份尿素，1-3份氯化胆碱及0.4-1份甘氨酸，溶于100-120份去离子水中，超声溶解；置于聚四氟乙烯内衬水热反应釜中，180℃恒温加热8～10h，反应完成后自然冷却至室温；（2）将所得溶液10000rmin下离心10-15min，0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3000-3500Da的透析袋进行透析处理24h，得到水溶性氯氮掺杂碳点。3.根据权利要求1所述的碳点模拟酶结合荧光探针检测多巴胺的方法，其特征在于：所述的酵母碳点由以下方法制备得到：（1）取2-5份酵母粉，溶于100-120份去离子水中，超声溶解；置于聚四氟乙烯内衬水热反应釜中，200℃恒温加热24h，反应完成后自然冷却至室温；（2）将所得溶液10000rmin下离心10-15min，0.22μm滤膜过滤，后用截留分子量为3000-3500Da的透析袋进行透析处理24h，得到水溶性酵母碳点。4.根据权利要求1所述的碳点模拟酶结合荧光探针检测多巴胺的方法，其特征在于：所述的酵母碳点最大激发波长为320nm，最大发射波长为404nm。5.根据权利要求1所述的碳点模拟酶结合荧光探针检测多巴胺的方法，其特征在于：所述纳米模拟酶氯氮掺杂碳点与多巴胺重量比为1：300-350。6.根据权利要求1所述的碳点模拟酶结合荧光探针检测多巴胺的方法，其特征在于：所述酵母碳点浓度为0.5-2.0gL，聚多巴胺浓度为0.1-100µM。

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