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申请/专利权人：中国科学院新疆生态与地理研究所

摘要：本发明涉及一种农杆菌介导的苔藓的稳定遗传转化方法，该方法涉及苔藓为小立碗藓Physcomitrellapatens和银叶真藓Bryumargenteum的原丝体或配子体，采用苔藓原丝体及配子体的培养，遗传转化及共培养，筛选培养及鉴定。以苔藓原丝体及配子体作为侵染材料，用携带目标基因的农杆菌工程菌液灌入培养皿中进行遗传转化。将苔藓用农杆菌直接侵染，转化周期短，能够在短时间里获得大量的转基因材料。相比较原生质体转化方法，本方法操作简单易控，周期短，转化效率高，表达强度好，成本低，为基因功能研究打下了基础。

主权项：1.一种农杆菌介导的苔藓稳定遗传转化方法，其特征在于按下列步骤进行：苔藓原丝体及配子体的培养基的配置：a、将苔藓原丝体或配子体放入灭菌的50毫升离心管中，加无菌水，用研磨仪研磨1分钟，磨成匀浆状，将苔藓原丝体匀浆液加入常规的PPNH4固体培养基中，培养基上均铺有无菌玻璃纸，生长6天作为转化材料，将配子体加入常规的改良KNOP固体培养基中，培养基上均铺有无菌玻璃纸，生长30天作为转化材料，其中所述苔藓为小立碗藓Physcomitrellapatens或银叶真藓Bryumargenteum；农杆菌转化和共培养：b、将含有目的基因的农杆菌单菌落放入农杆菌培养液中，于温度28℃，200rpm下震荡培养，待农杆菌菌液OD值为0.4-0.6时，以5500rpm，离心10分钟，收集菌体，再用以农杆菌培养液同体积的pH值为5.5的AB:MES重悬菌体，于温度28℃，200rpm的培养箱中培养12小时，以5500rpm，离心10分钟，收集重悬菌体，按体积比1:1的KNOP与AB:MES制成KNOP与AB:MES混合液，其中混合液中的乙酰丁香酮最终浓度为200μM，再次重悬农杆菌菌液OD值至0.6作为侵染液；侵染与共培养：c、将步骤a培养好的苔藓原丝体或配子体培养皿中加入步骤b得到的侵染液，将侵染液浸没苔藓，放置30分钟后吸出菌液，用保鲜膜封口，将培养皿放置在温度24℃黑暗条件下处理3天，黑暗培养结束后正常光照下培养一周后筛选培养；苔藓的筛选培养：d、将正常培养条件下培养7天的原丝体或者配子体加入2毫升的含有75微克每升潮霉素的无菌水筛选15天后进行检测，筛选后存活的苔藓为转基因成功的材料，在此培养期间，若发现有农杆菌污染的苔藓，可用无菌水清洗后再加入筛选液；抗性原丝体诱导分化成配子体：e、经步骤d筛选后的抗性原丝体转入改良KNOP固体培养基中，正常条件下培养4至5周，至生长出苔藓配子体；所述培养基及AB：MES配方为：AB：MES：17.2mMK2HPO4，8.3mMNaH2PO4，18.7mMNH4Cl，2mMKCl，1.25mMMgSO4，100μMCaCl2，10μMFeSO4，50mMMES，2%葡萄糖wv，pH=5.5，121℃,20min，冷却后加入200μM乙酰丁香酮；改良Knop培养基：CaNO32·4H2O1gL，FeSO4·7H2O13.5mgL，MgSO4·7H2O0.25gL，KCl0.25gL，KH2PO40.25gL，TES1mL，琼脂7gL，pH=5.5；PpNH4培养基:1×溶液A,1×溶液B,1×溶液C,1×alternativeTES,2.7mM酒石酸铵，pH=5.5，0.7%wv琼脂；a溶液A100×:0.5MCaNO32,4.5mMFeSO4；b溶液B100×:0.1MMgSO4；c溶液C100×:184mMKH2PO4，用4MKOH调pH6.5；AltemativeTESxl000L：CuSO4·5H2O55mg10mM，H3BO3614mg0.23mM，CoCl2·6H2O55mg0.1mM，Na2MoO4·2H2O25mg0.1mM，ZnSO4·7H2O55mg0.19mM，MnCl2·4H2O389mg2mM，KI28mg0.17mM。

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