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申请/专利权人：西南大学

摘要：本发明公开了一种产卵孢素球孢白僵菌菌株及其在CZB中合成卵孢素的应用，ops3是球孢白僵菌卵孢素合成基因簇中的转录因子，超量表达ops3能使球孢白僵菌在营养丰富的PDB和SDB中大量合成卵孢素，但却不能在营养贫瘠的CZB中合成卵孢素。本发明利用基因超量和敲除技术，在ops3超量表达的球孢白僵菌菌株中，破坏掉一个β‑葡萄糖苷酶基因Bbbgli1，获得了ΔBbbgli1‑ops3OE菌株，所得菌株在营养贫瘠的CZB培养基中能够大量产生卵孢素，而且菌株生长不受影响，为卵孢素大量生物合成提供了一个经济、高效的技术方案。

主权项：1.一种产卵孢素球孢白僵菌（Beauveriabassiana）菌株，其特征在于，为ΔBbbgli1-ops3OE菌株，该菌株由超表达ops3基因后，再敲除Bbbgli1基因得到的；所述ΔBbbgli1-ops3OE菌株采用如下方法获得：以球孢白僵菌基因组作模板扩增得到ops3基因，并将其克隆进pk2-bar载体的组成型启动子PgpdA下，得pk2-bar-ops3；具体包括：用引物p62794-O1为5’-GCTCTAGAATGTTTTACACTTTCAATGCTG-3’和p62794-O2为5’-GCTCTAGATCAAAACGAATATAATTCGGAA-3’，从基因组模板上扩增获得ops3片段，用限制性内切酶XbaI消化目标片段，回收后克隆进pK2-PgpdA中的XbaI位点；用pgpdA-1为5’-ACGCACCAGAGCTTCGTAGT-3’和p62794-O2扩增并筛选出方向正确的pK2-bar-gpdA-ops3载体，测序验证；2）将pk2-bar-ops3转入根癌农杆菌LBA4404后，利用根癌农杆菌介导球孢白僵菌的遗传转化，并经PCR筛选获得超量表达ops3的ops3OE菌株；3）以球孢白僵菌基因组作模板扩增得到Bbbgli1基因的左臂Bbbgli1L和右臂Bbbgli1R，分别构建进pk2-sur载体，得敲除载体pk2-sur-Bbbgli1L-bar-Bbbgli1R；具体为：以球孢白僵菌基因组为模板，分别利用引物对PBbbgli1LB1PBbbgli1LB2、PBbbgli1RB1PBbbgli1RB2扩增Bbbgli1基因的上下游序列，利用Vazyme公司的同源重组酶ClonExpress将其克隆进pK2-sur的EcoRIXbaI位点，获得所述敲除载体；其中，PBbbgli1LB1为5’-tatgaccatgattacgaattccgtcgcgtgtatgctgaaag，PBbbgli1LB2为tctgtcgacactagtgaattcgtggactgcaatgggtgaga-3’，PBbbgli1RB1为5’gaggtaatccttctttctagacaaggtgtcattgccagcac，PBbbgli1RB2为tgcctgcaggtcgactctagatacacacaactcccaccagc-3’；4）将pk2-sur-Bbbgli1L-bar-Bbbgli1R转入根癌农杆菌LBA4404后，利用根癌农杆菌介导法将pk2-sur-Bbbgli1L-bar-Bbbgli1R转入ops3OE菌株，并经PCR筛选获得DBbbgli1-ops3OE菌株。

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