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申请/专利权人：北京兴奋剂检测实验室

摘要：本发明涉及抗原—抗体蛋白质技术领域，具体为基于人EPO基因多态性c.577del的兔单克隆抗体及制备方法。该方法通过抗原的制备和单克隆抗体的制备相结合，从而生成仅特异识别VAR‑EPO的兔单克隆抗体；该兔单克隆抗体具有高亲和力高特异性的特点，可特异性高效结合人体尿液以及血液样本中的痕量VAR‑EPO，同时不识别WT‑EPO和rEPO，采用该抗体建立的双向免疫纯化联合蛋白免疫印迹技术可区分人体尿液以及血液样本中的rEPO和VAR‑EPO，直接准确检测来源于各类人群尿液以及血液样本中的rEPO，排除假阳性风险，优化兴奋剂检测流程，弥补目前世界反兴奋剂领域关于rEPO检测的缺陷。

主权项：1.基于人EPO基因多态性c.577del的兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1、采用基于人EPO基因多态性c.577del编码的VAR-EPO与WT-EPO的差异氨基酸链GDDDQVCPPGHIHHLPHQHCLCHTLPRHS设计并合成的多肽抗原CHTLPRHSGGGSHTLPRHS，进行兔免疫以获取特异性识别VAR-EPO的兔单克隆抗体；S2、经过S1五轮免疫后，取兔外周血并经流式分选后，将VAR-EPO和WT-EPO筛选浓度分别设定为10ngmL和100ngmL,ELISA检测结果OD值分别设定为大于等于1.00和小于等于0.10，用于筛选可分泌高度识别VAR-EPO且不识别WT-EPO的抗体的单个抗原特异性记忆B细胞，筛选得到的B细胞进行后续抗体表达纯化。S3、针对S2表达纯化得到的抗体，将VAR-EPO浓度设定为1ngmL,抗体浓度设定为1μgmL，ELISA检测结果OD值设定于大于等于0.95，用于进一步筛选可高效识别痕量VAR-EPO的兔单克隆抗体。S4、将S3筛选得到的抗体用于免疫亲和纯化，用于处理分别添加了150pgVAR-EPO的人体尿液样本和血液样本，纯化后的样本经蛋白免疫印迹检测VAR-EPO的信号强度。S5、针对S3筛选得到的抗体，将VAR-EPO包被量设定在7.81pg至1ng共八个水平，采用ELISA分别测定抗体量为1μg和0.1μg时EC50值。S6、综合S4和S5的结果，最终获得TYJ9-R0016，作为可特异性高效识别人体尿液和血液样本中痕量VAR-EPO的兔单克隆抗体。

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