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申请/专利权人：中国科学院南海海洋研究所

摘要：本发明公开了内源性接合质粒中成瘾性毒素‑抗毒素系统的敲除方法及其应用。采用本发明提供的敲除方法使得内源性接合质粒中成瘾性TA系统在敲除过程中成功地避开了PSK产生的细胞毒性作用，使得内源性接合质粒中成瘾性TA系统顺利敲除。本发明对TA系统的进一步科学研究包括其功能和应用研究有着重大贡献。

主权项：1.一种内源性接合质粒中成瘾性毒素-抗毒素系统的敲除方法，其特征在于，包括以下步骤：1使用PKD46温度敏感型质粒分别对pHNSHP45质粒的hicA,hicAB基因进行一步法敲除，得到质粒上hicA完全敲除的菌株BW25113pHNSHP45ΔhicA和hicAB不完全敲除的菌株BW25113pHNSHP45ΔhicAB-m，具体为：S1：制备BW25113pHNSHP45化学感受态细胞，通过化学转化将pKD46质粒转进BW25113pHNSHP45化学感受态细胞中，在含羧苄青霉素的固体平板上筛选阳性转化子BW25113pHNSHP45pKD46，将BW25113pHNSHP45pKD46制备成电转感受态细胞；S2：采用引物对KOhicA-F1R1、KOhicAB-F1R1，以pKD3基因组DNA为模板进行PCR扩增带有氯霉素抗性基因的同源性DNA片段；所述引物对KOhicA-F1R1的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示；所述引物对KOhicAB-F1R1的核苷酸序列如SEQIDNO.3-4所示；S3：将S2的PCR产物片段与S1的BW25113pHNSHP45pKD46电转感受态细胞进行同源重组，涂布于氯霉素抗性平板上筛选，获得质粒上hicA完全敲除的菌株BW25113pHNSHP45ΔhicA和hicAB不完全敲除的菌株BW25113pHNSHP45ΔhicAB-m；2将pUC19-hicB质粒通过化学转化转进未完全敲除hicAB的菌株BW25113pHNSHP45ΔhicAB-m感受态细胞中，筛选得到携带有pUC19-hicB质粒的完全敲除hicAB的菌株BW25113pHSNHP45ΔhicABpUC19-hicB；3将BW25113pHSNHP45ΔhicABpUC19-hicB接合转移到带有卡那霉素抗性基因的BW25113菌株中，得到完全敲除hicAB的菌株BW25113pHSNHP45ΔhicAB。

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