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申请/专利权人：连云港金康和信药业有限公司

摘要：本发明公开了一种基于LC‑MSMS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法，包括：将叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸和5‑甲基四氢叶酸配制混合标准溶液，将混合标准溶液加入到空白血浆中并加入稳定剂，再加入内标工作溶液，涡旋，离心，取上清液与稳定剂混合，进行LC‑MSMS检测，以待测物与内标峰面积的比值对其浓度做线性回归，得到标准曲线；取待测血浆，加入甲醇，再加入内标工作溶液和稳定剂，涡旋、离心，取上清液与稳定剂混合，进行LC‑MSMS检测，记录待测物与内标物对应的峰面积，计算峰浓度比，代入标准曲线，得到待测物的浓度。本发明解决了生物样品中叶酸类成分在分析中不稳定的问题，提高了准确性和可靠性。

主权项：1.一种基于LC-MSMS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法，其特征在于：该方法同时测定血浆中叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸的浓度，包括：步骤1、标准曲线的制备：将叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸配制成不同浓度的混合标准溶液，将混合标准溶液加入到空白血浆中并加入稳定剂，混匀，再加入内标工作溶液，涡旋，离心，取上清液与稳定剂混合，即为标准曲线样品溶液，进样LC-MSMS系统，按照液相色谱-质谱联用检测条件进行LC-MSMS检测，记录待测物对应峰面积，以待测物与内标峰面积的比值对其浓度做线性回归，得到相应的标准曲线；所述的稳定剂为二硫苏糖醇和抗坏血酸的混合水溶液；步骤2、待测血浆中叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸的测定：取50μL待测血浆，加入5μL甲醇，涡旋5～10s，再加入5μL二硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度均为5mgmL的稳定剂，涡旋10s，再加入300μL内标物的浓度为60～80μgmL、二硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度均为1mgmL的内标工作溶液，涡旋不小于1min，12000rpm离心不少于10min，取20μL上清液，与80μL稳定剂混匀，使得样品溶液中二硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度不小于0.9mgmL；进样LC-MSMS系统，按照液相色谱-质谱联用检测条件进行LC-MSMS检测，记录待测物与内标物对应的峰面积，计算峰浓度比，代入标准曲线，计算得到待测物的浓度；其中，液相色谱-质谱联用检测条件：液相色谱条件：AgilentZorbaxXDBC18色谱柱，规格50mm×2.1mm,3.5μm；柱温：室温；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸甲醇溶液；洗脱方式：0.00-0.50min，2％流动相B；0.50-1.00min，2％-100％流动相B；1.00-4.00min，100％流动相B；4.00-4.01min，100％-2％流动相B；4.01-5.00min，2％流动相B；流速：0.400mLmin；进样量：5μL；质谱条件：采用ESI源，负离子MRM模式检测；气帘气和雾化气均使用氮气，设定值分别为20和10psi；负离子模式下的源喷射电压设定为-4500V，叶酸的离子对：mz为440→311，碰撞能量为-27eV；二氢叶酸的离子对：mz为442→176，碰撞能量为-33eV；四氢叶酸的离子对：mz为458→286，碰撞能量为-33eV；5-甲基四氢叶酸的离子对：mz为458→329，碰撞能量为-36eV；所述的内标工作溶液是以苯妥英钠或同位素标记物C13-5-甲基四氢叶酸为内标物，并添加二硫苏糖醇、抗坏血酸，采用甲醇配制的内标溶液。

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