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申请/专利权人：石河子大学

摘要：本发明公开了一种杀线虫的少孢节丛孢菌几丁质酶AO‑59opt介孔二氧化硅纳米颗粒及其制备方法，包含少孢节丛孢菌几丁质酶AO‑59基因密码子的优化及基因合成，少孢节丛孢菌AO‑59opt基因真核表达重组载体的构建，少孢节丛孢菌几丁质酶AO‑59opt在毕赤酵母菌中的诱导表达和几丁质酶AO‑59opt介孔二氧化硅纳米颗粒的制备。本发明与普通的几丁质酶AO‑59相比，制备的几丁质酶AO‑59opt介孔二氧化硅纳米颗粒（AO‑59opt‑MSNs）不但酶学稳定性显著增加，同时对几丁质的分解活性显著提高，对绵羊粪便中的捻转血矛线虫L3幼虫的杀灭活性和虫卵的裂解活性也显著增强，为新型高效杀线虫生物防控制剂研发奠定了基础。

主权项：1.一种杀线虫的少孢节丛孢菌几丁质酶AO-59opt介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于包含以下过程：少孢节丛孢菌几丁质酶AO-59基因密码子的优化及基因合成，少孢节丛孢菌AO-59opt基因真核表达重组载体的构建，少孢节丛孢菌几丁质酶AO-59opt在毕赤酵母菌中的诱导表达，几丁质酶AO-59opt介孔二氧化硅纳米颗粒的制备；具体过程如下：少孢节丛孢菌几丁质酶AO-59基因密码子的优化及基因合成：分析几丁质酶AO-59基因密码子组成，依据毕赤酵母P.pastoris密码子偏爱性，在不改变其氨基酸序列组成的前提下进行核苷酸序列密码子优化，将少孢节丛孢菌几丁质酶AO-59基因中毕赤酵母中编码精氨酸Arg的稀有密码子CGC、CGA、CGG、AGG突变为偏爱密码子AGA，序列分析显示，在几丁质酶AO-59基因序列中共发现了13个毕赤酵母Arg稀有密码子，因此在原核苷酸序列的基础上同义突变了13个氨基酸位点序列，将改造后的几丁质酶基因命名为AO-59opt，经毕赤酵母偏好密码子优化后，将AO-59opt基因核苷酸序列进行全长基因的人工合成，得到密码子优化后的少孢节丛孢菌几丁质酶AO-59基因；少孢节丛孢菌AO-59opt基因真核表达质粒的构建：根据密码子优化后的几丁质酶AO-59opt基因序列，设计特异性上游和下游引物，并分别在引物5‘端引入的限制性内切酶AvrII和NotⅠ识别位点，以合成的全长几丁质酶AO-59opt基因cDNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，利用DNA凝胶回收试剂盒回收扩增的目的片段，然后用AvrII和NotⅠ分别双酶切目的基因和真核表达载体pPIC9K，分别回收后，用T4DNA连接酶进行连接，利用PCR和双酶切方法鉴定得到真核表达载体pPIC9K-AO-59opt；少孢节丛孢菌几丁质酶AO-59opt在毕赤酵母菌中的诱导表达：将筛选出的阳性毕赤酵母转化子接种于含G41880～120mgmL的4～6mLYPD液体培养基中，28±1℃，150～250rmin培养至OD600＝1.0，取0.8～1.2mL上述液体接种到180～220mLBMGY液体培养基中，28±1℃，150～250rmin培养至OD600＝3.0，常温2000～4000rmin离心4～6min，将收集的菌体用180～220mLBMMY含0.4～0.6％液体培养基重悬菌体，28±1℃，150～250rmin继续培养，每隔18～30h补加甲醇至浓度为1.2～1.6％，90～100h收菌，常温下10000～15000rmin离心8～12min弃菌体，收集上清液-20℃以下保存备用；几丁质酶AO-59opt介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：采用物理吸附的方法，具体参照Vertegel步骤使几丁质酶AO-59opt和二氧化硅颗粒吸附，先用用pH7.5±0.1的磷酸缓冲液配制8～12mgmL几丁质酶AO-59opt溶液，再用相同pH的缓冲液配制8～12mgmL孔径为30-50nm的二氧化硅纳米颗粒溶液，各取8～12mL几丁质酶AO-59opt溶液和二氧化硅纳米颗粒溶液使酶和载体质量比为1:1，在室温下用电动搅拌器搅拌吸附3～5h，得到几丁质酶AO-59opt介孔二氧化硅纳米颗粒AO-59opt-MSNs溶液，将制备的AO-59opt-MSNs进行冷冻真空干燥，得到粉状的AO-59opt-MSNs颗粒。

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