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申请/专利权人：上海奕检智造生命科技有限公司

摘要：本发明公开了一种用于检测鼻病毒分型的RT‑PCR方法，本发明涉及基因检测技术领域。检测鼻病毒分型的RT‑PCR方法是选择鼻病毒的6条参考序列进行序列比对，以其中一条参考序列5’NCR相对保守区域设计一对引物和一条探针，以引物和探针的序列为参考区域，结合6条参考序列相应位置的变异情况，在上下游参考引物和探针位置分别左右移动1‑20bp，得到可覆盖相应变异位点的引物集和探针集，将引物集和探针集作为一个反应体系，进行RT‑PCR检测。本发明的优点在于：通过选择鼻病毒多条参考序列，在相对保守区域设计对应的引物集和探针集，在同一体系可鉴定出不同型别的鼻病毒，且检测覆盖鼻病毒A、B、C组型别。该法具有操作简便、经济快速，覆盖多型别的特点。

主权项：1.一种用于检测鼻病毒分型的RT-PCR方法，其特征在于：选择鼻病毒的6条参考序列进行序列比对，以其中一条参考序列5’NCR相对保守区域设计一对引物和一条探针，以引物和探针的序列为参考区域，结合6条参考序列相应位置的变异情况，在上下游参考引物和探针位置分别左右移动1-20bp，得到可覆盖相应变异位点的引物集和探针集，将引物集和探针集作为一个反应体系，进行RT-PCR检测，所述用于检测鼻病毒分型的RT-PCR方法具体操作步骤如下：步骤一、设计目的基因和内参基因的引物和探针选择鼻病毒的6条参考序列进行序列比对，序列覆盖鼻病毒A、B、C组型别，以其中一条参考序列5’NCR相对保守区域设计一对引物和一条探针，以引物和探针的序列为参考区域，结合6条参考序列相应位置的变异情况，在上下游参考引物和探针位置分别左右移动1-20bp，得到可覆盖相应变异位点的引物集和探针集，并针对人的内参基因GAPDH设计一对引物和探针,将引物集和探针集作为一个反应体系，进行RT-PCR检测；步骤二、引物探针准备将以上设计得到的所有引物探针序列进行生物合成后，将其分别稀释到10uM的工作浓度，备用；步骤三、标本准备准备经过高通量测序验证过的已知阳性结果的RNA阳性样本3例、已知的阴性样本1例以及阴性对照ddH2O1例，使用RNA定量试剂和定量仪器Qubit3.0进行定量检测RNA的浓度，确保RNA的浓度大于1nguL；步骤四、标本处理先去除基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠，再进行第一链cDNA合成反应；步骤五、体系配置将RNA反转录后cDNA作为模板，加入上述稀释得到的工作浓度的引物集和探针集以及扩增试剂，进行扩增反应体系配置；步骤六、PCR扩增将配置好的反应体系，置于荧光定量PCR仪上，进行PCR扩增反应；步骤七、结果判断设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值一般可在3～15范围内调节、stop值一般可在5～20范围内调节，以及Threshold的Value值上下拖动阈值线至高于阴性对照，重新分析结果；步骤八、结果分析根据判断规则，对扩增的结果进行分析，判定是否检出病原核酸片段。

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