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申请/专利权人：深圳市萨米医疗中心

摘要：本发明公开了小片段DNA的检测方法及检测试剂盒，属于基因检测技术领域。所述检测方法为：1针对目标检测基因，设计得到特异性正向引物、特异性反向引物和探针；在特异性的正向引物的5’端连接一段含有延伸阻滞剂的茎环结构得到茎环引物；所述探针的5’端连接荧光基团，3’端连接淬灭基团BHQ；2QPCR检测。所述检测试剂盒包括针对目标检测基因设计的茎环引物、特异性正向引物、特异性反向引物和探针，以及QPCR检测方法所必需的试剂。本发明的检测方法，在单管中即可实现目标片段的检测，操作简便、快速，灵敏度高，特异性强，检测结果准确，适用于血清、血浆等样本的游离DNA的简单快读提取和SRY性别鉴定。

主权项：1.一种小片段DNA的非疾病诊断检测方法，其特征在于，步骤如下：（1）引物和探针的设计：针对人SRY基因，设计3对SRY引物探针组合，分别命名为SRY1、SRY2、SRY3；SRY引物探针组合由茎环引物、特异性正向引物、特异性反向引物和探针组成；在特异性的正向引物的5’端连接一段含有延伸阻滞剂的茎环结构得到茎环引物，所述含有延伸阻滞剂的茎环结构的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其中，延伸阻滞剂为下划线所示的甲基化的CpG结构，第11、13、15位的碱基为5－甲基胞嘧啶；SEQIDNO.1：5’-AGCCATCCAGCGCGCGGCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCT-3’；所述SRY1的茎环引物、特异性反向引物、特异性正向引物和探针的核苷酸序列如SEQIDNO.2～5所示，其所针对的是40bp的小片段DNA；SEQIDNO.2：5’-AGCCATCCAGCGCGCGGCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTTCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCA-3’；SEQIDNO.3：5’-CACACGATGAATGCGT-3’；SEQIDNO.4：5’-TCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCA-3’；SEQIDNO.5：5’-ROX-TAGAGTGAAGC-BHQ1-3’；所述SRY2的茎环引物、特异性反向引物、特异性正向引物和探针的核苷酸序列如SEQIDNO.6～9所示，其所针对的是62bp的小片段DNA；SEQIDNO.6：5’-AGCCATCCAGCGCGCGGCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTAGAGTGAAGCGACCCATGA-3’；SEQIDNO.7：5’-GCCATCTTGCGCCTC-3’；SEQIDNO.8：5’-AGAGTGAAGCGACCCATGA-3’；SEQIDNO.9：5’-FAM-TCGTGTGGTCTCG-BHQ1-3’；所述SRY3的茎环引物、特异性反向引物、特异性正向引物和探针的核苷酸序列如SEQIDNO.10～13所示，其所针对的是84bp的小片段DNA；SEQIDNO.10：5’-AGCCATCCAGCGCGCGGCTGTGGATCGGTAGTAGGATGGCTTGGATAGTAAAATAAGTTTCG-3’；SEQIDNO.11：5’-GAAGCATATGATTGCATTG-3’；SEQIDNO.12：5’-TGGATAGTAAAATAAGTTTCG-3’；SEQIDNO.13：5’-HEX-GCACCTTTCAATTTTGTCG-BHQ1-3’；（2）QPCR检测：提取陈旧冻存血浆样本中的小片段DNA，利用步骤（1）中设计得到的引物和探针组合，利用QPCR检测方法进行扩增和检测，根据检测结果，判断待检测样品中是否含有目标检测基因；所述陈旧冻存血浆样本中的小片段DNA的长度为40～200bp。

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